Nature | 浙江大学团队揭示巨噬细胞通过GSDMD释放代谢物促进衰老组织再生新机制

Gsdmd^CKO小鼠、Ephx2^CKO小鼠、临床人肌肉样本来源的MUSCs、小鼠原代巨噬细胞

单细胞转录组、转录组、Olink（Target 96 Mouse Exploratory Panel）、非靶代谢组、靶向脂质代谢组等

研究者首先构建了Gsdmd^CKO小鼠， MuSCs数量不受影响，但多种指标都表明肌肉愈合过程减缓。巨噬细胞耗竭后， Gsdmd^CKO小鼠的再生过程有一定的恢复。这些数据表明，GSDMD在肌肉损伤期间的促再生作用主要依赖于肌内巨噬细胞群。

Gsdmd^CKO小鼠显示出Pax7、MyoD和MyoG等与MuSCs的激活程序相关基因的mRNA水平降低，且MuSCs的增殖明显减弱，分化水平依次降低。随后，研究者观察到再生过程中GSDMD蛋白会在肌内巨噬细胞中发生降解。此外，GSDMD缺乏在再生早期不影响巨噬细胞的急性浸润，且并没有改变组织再生的一个关键指征：血管密度。总的来说，这些数据表明GSDMD是最佳肌肉修复所必需的，对损伤后早期炎症生态位的建立影响较小。

研究人员收集了再生早期(第2天)和晚期(第10天)的肌肉组织进行单细胞测序，将损伤后的MuSCs分为6个连续状态，连续转变与其再生潜能呈负相关。Gsdmd^CKO使得PI3K-AKT和FGFR-MAPK通路的抑制以及其中关键级联信号的磷酸化水平降低进而抑制MuSCs的激活，导致增殖和分化水平下降。

已有证据表明肌肉再生与从初始炎症到晚期促再生微环境的时间过渡有关，因此研究者从包含炎症(inflammatory index)和促再生(regenerative index)基因集的免疫细胞中定义了三种亚群： Spp1^high巨噬细胞、Mrc1^high巨噬细胞和Ccr2^high单核细胞，它们在损伤后急性期上调炎症程序，在后期转变为促再生表型。也就是说，骨髓表达的Gsdmd可能是再生过程中肌内免疫成分时间过渡所必需的。

另外，已知GSDMD蛋白通过其N端片段寡聚化形成的孔隙促进各种促炎介质的分泌，从而执行细胞焦亡。实验证实了Gsdmd^f/f小鼠中N端片段寡聚现象显著，但并不影响质膜破裂事件。对肌内分泌物进行了多个OLINK panel检测，覆盖了参与炎症、再生和应激反应等的促炎介质，观察到GSDMD缺乏对整体间质液组成的影响很小，即再生早期Gsdmd N端片段寡聚化可能不会直接导致裂解性焦亡，但可能诱发过度活跃状态。

研究人员在体外模拟GSDMD激活后巨噬细胞的过度活跃状态，再将培养上清提供给小鼠成肌细胞，发现肌生成电位增加，因此假设通过GSDMD孔隙会积极分泌某些小分子可以促进肌肉生成。随后对GSDMD激活模型进行非靶向代谢组学检测，发现11,12-环氧二碳三烯酸(EET)在高活性甘氨酸处理的巨噬细胞的上清液中以GSDMD依赖的方式持续富集。11,12- EET是一种由磷脂自然转化的二十烷酸。进一步对二十烷类化合物家族进行靶向代谢组检测再次确认了11,12- EET以GSDMD依赖的方式积极分泌。

随后，研究者在急性损伤时确定了三种不同的分泌模式：“早期分泌”(1-5 dpi)，“短暂分泌”和“晚期分泌”(5 dpi)。体外补充11,12- EET加速了成肌细胞系的成肌能力。此外，11,12- EET和对照巨噬细胞的上清液都增强了MuSCs的增殖，表明依赖GSDMD的11,12- EET分泌直接影响肌肉再生。

接下来研究者构建可溶性环氧化物水解酶(由EPHX2编码)缺失小鼠（Ephx2^CKO）从而破坏EET水解过程，以导致体内EET水平的积累。Ephx2^CKO小鼠肌肉再生加速，肌肉坏死和再生面积减少，肌纤维分布扩大，肌肉力量和重量增加，促进了MuSCs肌生成过程的连续基因表达，在6 dpi时eMyHC⁺早期再生肌纤维减少，加速了MuSCs的增殖能力，加快了MYOD和MYOG蛋白的表达水平，且这种对肌肉再生的贡献依赖于GSDMD激活。给药双硫仑(DSF)，一种有效的GSDMD孔隙形成抑制剂，抵消Ephx2缺乏的促再生作用。也就是说，巨噬细胞释放的11,12-EET的促再生潜能在体内依赖GSDMD的成孔隙功能。

体外激活MuSCs的转录组数据表明11,12-EET处理显著上调了一些细胞质翻译、线粒体呼吸活动、细胞周期、分化的肌球蛋白基因的表达水平。早期激活的MuSCs具有更高水平的FGFR基因表达，这表明FGF-FGFR轴是肌肉内可以激活PI3K-AKT-mTOR和MAPK通路的主要信号之一。对MuSC的单细胞转录组数据中每个基因与FGF信号评分之间的相关水平进行排序，与更高的FGF信号传导呈正相关的top基因显著富集了细胞外结构和生长因子结合能力等条目，这些条目是FGF- FGFR信号传导的充分启动和转导所必需的，并且与FGF的生化特性密切相关。总地来说，11,12- EET作为一种脂质，能够增强膜表面FGF的相分离，从而有效地放大下游信号。在CTX损伤小鼠中证实了11,12- EET在体内同样有效增强了FGF-FGFR信号通路的激活，而FGFR抑制剂显著抑制了这一信号通路。

接下来研究者着重阐明11,12-EET在体内组织修复中的治疗潜力。肌内注射11,12-EET显著改善了肌肉再生，且促再生能力依赖于FGFR。考虑到FGF在各种组织再生过程(如角膜和皮肤损伤)中具有广泛的促进再生能力，研究者测试了11,12-EET是否在其他损伤模型中促进组织再生。在角膜损伤模型、穿刺活检诱导的皮肤损伤模型、紫外线诱导的皮肤损伤模型中， 11,12-EET治疗均显著改善了损伤相关症状。研究者还发现衰老肌肉中EPHX2升高，导致肌内11,12- EET水平下降。给老龄小鼠补充11,12- EET可以显著恢复衰老肌肉的活力。对公共数据集的分析了发现EPHX2在老年人的肌肉中的表达水平随着年龄的增长而升高。临床手术产生的肌肉碎片分离HMUSCs并进行11,12-EET处理显著提高了HMUSCs的增殖能力。总之，从GSDMD孔隙释放的11,12- EET具有普遍的促修复潜力，以及使衰老肌肉恢复活力的能力。