Immunity(IF=32.4) | 细胞“侦探团”出击：单细胞和空间组学告诉你联合免疫为何更强

单中心、前瞻性研究策略，机会窗口研究；样本来源：诊断为可切除的局部晚期口腔鳞状细胞癌的患者。手术前14天接受单剂量度伐利尤单抗（抗PD-L1；A组；N=10）或度伐利尤单抗+曲美木单抗联合治疗（抗PD-L1+抗CTLA4；B组；N=10），在诊断时（治疗前）和手术期时(治疗后)共采集2次肿瘤活检组织（20对配对样本），以及手术时的外周血样本（n = 17）、口腔癌旁组织（n = 16）和肿瘤引流淋巴结（tdLNs；N=17）。

由于给予一次ICB治疗后的T细胞克隆型扩增在多个周期的ICB治疗后转化为基于RECIST的临床响应情况，因此研究人员使用克隆扩增作为治疗响应的替代标志。治疗前高比例T细胞不能预测治疗后的T细胞扩增，而治疗后49.27%的T细胞克隆在治疗前未被检测到。克隆扩增型T细胞和未发生克隆扩增的T细胞比较（治疗后的活检样本）：扩增T细胞中细胞毒性/T细胞活化标志和免疫细胞归巢标志表达上调，而初始T细胞和免疫调节标志表达下调。这些差异支持T细胞扩增反映了对ICB的持续免疫反应。之后也探索了肿瘤活检中哪些细胞表达抗PD-L1或抗CTLA4靶向的分子。而基于Spearman对每个患者治疗前活检样本中细胞亚群基因表达水平（免疫检查点相关基因）与T细胞克隆扩增的相关性分析显示，CD8+T细胞的PD-1特异性表达与抗PD-L1单药治疗的T细胞克隆扩增相关，aPD-L1+aCTLA4治疗组中髓细胞的PD-L1和CD80表达与T细胞扩增相关，着表明PD-1和CTLA4通路在联合治疗组中都是有效靶向的。

为了评估单抗或联合免疫治疗对患者T细胞扩增状态的影响，研究人员使用单细胞测序（scRNA-seq）对患者肿瘤组织进行了免疫细胞分析。结果显示接受了aPD-L1治疗的患者体内多个CD8⁺T细胞亚群出现上调，而CD4⁺T细胞没有出现扩增。与aPD-L1单独治疗相比，aPD-L1+aCTLA4联合治疗的活检样本即便CD8⁺T细胞出现了相同的扩增情况，但CD4⁺T细胞比例相较于aPD-L1治疗更高，且扩增的CD4⁺ Tem和Th1细胞比治疗前增多。随后作者重建了CD4⁺ T细胞的分化轨迹，结合TCR的信息发现相较于单免疫治疗，联合免疫治疗前的CD4⁺Tn/cm细胞与治疗后的CD4⁺Tem和Th1细胞共享更多的TCR，且大多数为克隆扩增型，提示联合治疗诱导CD4⁺Tn/cm向Tem或Th1细胞扩增。最后为了证实CD4⁺T细胞的活化在治疗组之间是不同的，作者计算了沿CD4⁺Th1轨迹的T细胞密度分布，发现CD4⁺T细胞在aPD-L1+aCTLA4联合免疫治疗后后明显向分化轨迹的末端移动。总而言之，aPD-L1+aCTLA-4联合治疗则促进了CD4⁺ T细胞的激活和扩张，特别是具有T辅助1（Th1）表型的细胞。

为了深入了解与T细胞扩增相关的TME的空间组织，作者也对部分样本（3例T细胞克隆型扩增、4例非T细胞克隆型扩增患者）进行了10X Visium空间转录组学检测。结果发现，反卷积后的空转数据与scTCR-seq的数据展示除了T细胞扩增的一致性。并且与单独aPD-L1治疗相比，aPD-L1+aCTLA4联合治疗组有更高比例的扩增性spot（空间转录组数据点）表达CD4和CD8A/B阳性。

为了进一步确定T细胞的空间分布状态，研究人员使用空间蛋白组学技术，对克隆扩增型CD4T细胞（CD3e⁺/CD4⁺/Ki67⁺）、CD8⁺T细胞（CD3e⁺/CD8⁺/Ki67⁺）进行了空间定位验证，结果发现相比于aPD-L1治疗，联合治疗的患者肿瘤组织中扩增的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞出现了更多的共定位。同时研究人员还分析了Th1、CD8⁺Tem、和Tex细胞的标志物，发现以上细胞的标志物主要分布在CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的共定位区域，这个结果也验证了scRNA-seq的发现。空间蛋白组技术明确了T细胞扩增的空间特征，即在联合治疗时，CD4⁺T细胞也会出现扩增，且在空间位置上与CD8⁺T细胞邻近。

接下来，研究团队对TME中的免疫细胞类型进行了亚聚类，并探讨了它们在T细胞扩增中的作用。结果发现，治疗前CXCL9/10/11+募集的migDC（迁移性DC）的丰度与T细胞扩增相关，并促进抗肿瘤1型免疫反应。在治疗后，migDC在两个治疗组中均与T细胞扩增呈正相关。另外也观察到T细胞扩增与B细胞驱动的抗肿瘤免疫环境中相关基因的表达呈正相关，并且在aPD-L1治疗后，B细胞扩增与T细胞扩增显著相关。关于aPD- L1+aCTLA-4治疗组中B细胞扩增与T细胞扩增相关性问题，由于该组中只检测到较少的B细胞克隆型使得其相关性很难去探索。

接下来，作者利用空间转录组数据在空间背景下探索了T细胞扩增的TME特征。首先通过单细胞测序分析了与T细胞扩增相关的通路，发现T细胞活化、细胞毒性和MHC I型抗原呈递相关基因部分上调，并且上述基因集/通路在空转数据中呈现上调的表达趋势，提示髓系细胞和T细胞的强烈共定位状态。接下来研究人员使用空间蛋白组验证髓系细胞与T细胞的共定位，结果显示在含有扩增T细胞的区域内，髓系细胞出现的频率较高。同时研究人员还分析了扩增T细胞与浆细胞的空间位置，发现两者也出现了共定位的现象。这种空间上的关系预示着细胞间可能存在互作，研究人员通过相关性分析发现，表达抗原呈递和T细胞归巢基因的DC与T细胞扩增相关，同时T细胞扩增与IgG+浆细胞的扩增相关。

最后，该研究也重点分析了肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和肿瘤组织中T细胞的动态变化。通过scRNA-seq数据分析发现接受治疗的患者的tdLNs中T细胞主要由初始/中央记忆CD4⁺T（CD4⁺Tn/cm）细胞组成，在两个治疗组之间无差异；而肿瘤中主要以效应T细胞为主。研究人员接着对两种疗法患者的肿瘤和tdLNs的scTCR-seq数据进行了分析，发现了在aPD-L1+aCTLA4治疗时tdLNs部位的CD4⁺Tn/cm细胞会被招募，并进行分化和扩增，从而转变为效应T细胞实现对肿瘤细胞的杀伤，而aPD-L1治疗患者肿瘤部位效应T细胞的含量则相对较少，这也是联合治疗对肿瘤杀伤效果更好的原因之一。总体而言，在aPD-L1+aCTLA4联合治疗时，CD4⁺Tn/cm细胞通过血液从tdLNs向肿瘤运输，随后这些T细胞分化为CD4⁺ Tem或Th1细胞发挥抗肿瘤的作用。