项目文章AFM（IF 19）| 腰椎病不再来！陆军军医大学新桥医院揭示动态水凝胶神奇疗效

动态水凝胶，NPCs细胞和 IVD组织，大鼠模型

首先作者从GEO数据库中提取人类IDD数据集GSE34095和GSE70362整合分析了疾病异常代谢特征，对差异基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示铁死亡和乳酸代谢都参与了IDD的发病机制。在上述生物信息学分析的基础上，作者根据腰椎间盘退变程度将患者分为II级、III级、IV级和V级四组实际检测相关理化指标，结果表明乳酸和亚铁离子与IVD退行性变的严重程度呈正相关。进一步通过检测铁死亡和乳酸代谢相关蛋白表达情况，以及氧化应激状态下的髓核细胞相关指标。结果证明铁死亡和乳酸积累是IDD的重要驱动因素。

冬凌草甲素具有良好抗炎作用，但由于其疏水性限制了在该疾病中的临床应用。研究团队根据椎间盘退变中的髓核微环境构建了一种兼具pH响应性释放功能性药物和环境适应性机械性能增强的动态水凝胶（HPGO）。通过透射电镜、扫描电镜、动态光散射测量、纳米滴分光测定、FTIR光谱、核磁共振、X射线衍射等技术手段进行表征，并进行粘附能力测试及力学性能评估。HPGO具有pH响应性释放的行为，能够针对髓核细胞外基质微环境响应性释放GDF-5，促进髓核细胞的基质合成代谢。同时，髓核细胞膜包被的冬凌草甲素由于同源细胞膜的高亲和性，因此具有高效靶向髓核细胞的作用。此外，研究人员利用动态水凝胶中席夫碱具有金属离子高亲和性的特点，使其与微环境中游离的亚铁离子结合，在抑制铁过载并提供合适微环境的同时增加动态水凝胶的交联程度，提高能量耗散位点数量。从而实现动态水凝胶机械强度环境适应性增强，有利于动态水凝胶在治疗过程中发挥力学支撑作用。

为了验证HPGO对NPCs的治疗作用，研究团队建立了氧化应激下NPCs与动态水凝胶的共培养体系。通过细胞活力测定显示HPGO有良好的细胞相容性，对退行性NPCs具有明显的细胞保护作用。进一步通过qPCR和WB技术检测铁死亡相关分子表达情况，体系亚铁离子和脂质过氧化水平。结果表明HPGO可以缓解氧化应激下NPCs中与铁死亡相关的脂质过氧化。为了进一步探索HPGO的抗铁过载性，作者使用柠檬酸铁铵(FAC)构建疾病相关铁过载细胞模型并进行检测。结果表明HPGO中席夫碱席夫碱具有金属离子高亲和性的特点，使其与微环境中游离的亚铁离子结合，从而抑制铁过载。此外，研究团队通过检测炎症因子、EMC相关相关标志物的表达水平以及免疫荧光(IF)分析细胞外基质代谢失衡修复能力。结果表明HPGO具有pH响应性释放的行为，能够针对髓核细胞外基质微环境响应性释放GDF-5，促进髓核细胞的基质合成代谢。在炎症因子及乳酸刺激下，HPGO可抑制基质降解。

为了进一步阐明HPGO水凝胶介导的细胞保护作用的可能机制，研究团队对与HPGO共培养的NPCs进行了转录组测序和生物信息学分析。对差异基因进行KEGG富集分析，结果表明上调基因主要参与MAPK、HIF-1、FoxO、p53和PI3K-Akt信号通路，这些信号通路被报道与抑制铁死亡有关。而下调基因则与调节氧化磷酸化、活性氧和蛋白酶体活性的途径显著相关。随后，通过分析DEGs-Up与铁死亡抑制基因的交集以及DEGs-Down与铁死亡驱动基因的交集，获得35个可能与HPGO介导的抑制铁死亡相关的基因，利用STRING数据库建立35个基因的PPI网络并进行分析。结果提示，Nfe2l2和Hmox1可能是HPGO介导的抑制铁死亡相关的基因，并用RT-qPCR验证结果。结果表明HPGO激活Nrf2信号通路抑制氧化应激下髓核细胞铁死亡的发生，协同促进髓核组织再生。

基于其在体外对退行性NPCs的修复作用，研究团队使用大鼠IDD模型进一步评估了动态水凝胶在体内的治疗效果。术后42天，从大鼠尾部收集IVD样本，通过x射线成像和MRI进行评估。可注射动态水凝胶优异的力学性能可以有效维持IVD的结构和功能，并与同时给药的GDF-5和NMO相结合，提高最终的治疗效果。通过组织病理结果检测，评估与ECM代谢、炎症和Ferroptosis相关的蛋白质标志物的体内表达水平，表明HPGO可以有效促进NP再生，延缓IDD的进展。基于体外实验证明，HPGO水凝胶可以减少细胞内亚铁离子和脂质过氧化，研究团队进一步验证了HPGO在大鼠IDD模型中也具有抑制铁死亡的作用。

为了进一步探讨HPGO注入NP区后的IVD修复效果，研究团队在术后42天提取相应的IVD，测试其可压缩性。对比分析了动态水凝胶处理后的IVD与正常IVD和退化IVD的压缩性能。压缩应力-应变曲线表明HPGO可提高退化IVD抗疲劳能力。动态水凝胶在治疗过程中发挥力学支撑补偿功能，实现组织结构和生物力学的有效恢复，有效解决退变髓核力学性能下降导致椎间盘退变加速的问题，为治疗椎间盘退变提供了新策略和科学依据。