Cell子刊 | 缺氧致癌再添实锤！缺氧肿瘤代谢微环境中的髓系细胞产生肌酸，促进胶质母细胞瘤生长

为明确GBM的髓系细胞的代谢特征，作者分析了5位诊断为GBM患者的CD163+的外周单核细胞和肿瘤组织的巨噬细胞的代谢组，鉴定到最显著的差异代谢物为肌酸、胍基乙酸（GAA）、磷酸肌酸等通路的代谢物，其中最为显著的GAA是精氨酸合成肌酸的重要中间产物。因此，肌酸代谢通路成为作者进行后续研究的重要切入点。

作者想要进一步探索肌酸代谢通路在空间上的激活情况，就GBM患者的肿瘤组织进行了单细胞测序和空间代谢分析。作者用了一个GBM的单细胞测序公共数据分析了髓系细胞的表达，鉴定到肌酸代谢通路的关键酶GATM和GAMT在CD163高表达的θMa和θMb亚群中特异高表达。

而后作者就转录分子特征，包括代谢酶的表达和细胞类型的signature，与代谢分子特征，包括肌酸、GAA、磷酸肌酸、甘氨酸、精氨酸这几个关注代谢物，进行了相关性分析。结果显示GATM与肌酸、GAA、磷酸肌酸和甘氨酸具有高度的相关性，而这些代谢物与θMa亚群中含量最高，在其它除了胶质细胞的髓系细胞中均有较多的积累。此外，GAMT和GATM也确实在θMa细胞中表达最高。因此，θMa亚群细胞是后续研究的关键细胞亚群。

作者分析了θMa亚群细胞的空间定位，结果显示这群细胞富集于缺氧区域，并结合基GAMT、GATM的表达以及GAA代谢通路的表达，说明肌酸代谢旺盛的髓系细胞定位于GBM的缺氧区域和坏死周围区域（图1）。

为进一步明确TAMCs在缺氧和坏死周围区域的定位，作者针对GBM样本进行了mIHC研究。结果显示，CD163+的细胞在CA9+的缺氧区域显著富集，而TMEM119+胶质细胞则没有富集于缺氧区域。作者利用CT-2A神经胶质瘤小鼠模型也得到了一致的结论。而后就小鼠模型进行单细胞测序分析，Gatm在TAMCs特异表达，而肌酸运输基因Slc6a8在肿瘤细胞的表达最高。以上结果说明计算代谢在缺氧区域高，并且是髓系细胞产生、肿瘤细胞吸收。

作者针对两个小鼠的GBM模型进行代谢组学测定分析，鉴定到肌酸和磷脂肌酸的含量砸TAMCs中高度积累，RNAseq分析鉴定到肿瘤中肌酸代谢酶Gatm表达显著升高。作者随后用同位素标记的精氨酸处理模型小鼠分离的TAMCs、脾脏的单核细胞和CD8 T细胞，只有TAMCs可鉴定到同位素，说明仅肿瘤的TAMCs促进了精氨酸依赖的肌酸合成（图2）。

为进一步揭示TAMCs上调肌酸代谢的机制，作者对TME分选的TAMCs进行缺氧和酸处理，用qRT的方法鉴定GATM和GAMT的表达，结果显示缺氧和酸处理可以协同地促进这两个基因的表达，并且这个激活过程是HIF依赖的（图3）。

作者分析了空间转录组数据上上述基因的表达情况，鉴定到肌酸合成酶GATM和GAMT在坏死区域外围表达，而肌酸输入单边SLC6A8在坏死区域表达，两者呈现显著的区域化。而后作者就坏死进行空间轨迹分析，进一步验证了在空间的表达模式（图4）。

为进一步验证肌酸摄入对肿瘤细胞的作用，作者讲CT-2A细胞系进行缺氧联合肌酸处理，MTT实验显示两者协同地促进肿瘤生长；而后用肌酸摄入抑制剂BPA和肌酸激酶抑制剂cyclocreatine处理，肿瘤细胞存活下降，进一步说明了肌酸对肿瘤细胞生长的促进作用。

进一步地，作者构建了Slc6a8 CRISPR敲除小鼠，用同位素标记的肌酸处理小鼠后，检测到敲除小鼠的肿瘤细胞对肌酸和磷酸肌酸的摄入大大降低，小鼠生存更好。在其它细胞系里敲减Slc6a8，得到了一致的结论（图5）。

作者随后验证了GPA作为对代谢物摄入的抑制作用，作者用同位素标记的精氨酸进行transwell实验，而后将肿瘤细胞进行代谢组学分析，结果显示缺氧提高肌酸含量，而GPA处理则大大降低肌酸含量。随后作者用ELDA实验验证肿瘤细胞的干性，结果显示肌酸处理在缺氧情况下提高肿瘤的干性，而GPA处理大大降低了其对干性的提升。

作者就GPA的临床应用开展了I期临床实验，肌酸摄入抑制剂化合物RGX-202-01处理联合放疗具有很好的疗效。进一步地，作者构建了在TAMCs条件敲除GATM的小鼠模型，条敲小鼠的肌酸等代谢物大大降低，预后更好。进一步说明了靶向肌酸代谢在GBM治疗中的应用前景（图6）。