宿主细胞蛋白残留检测：质谱法鉴定和定量分析
2023-09-28
中科新生命
11628重组生物制品主要是通过宿主细胞（例如细菌、酵母或哺乳动物、昆虫或植物细胞系）进行表达和纯化得到。在重组蛋白生产过程中，宿主细胞还共同产生与正常细胞功能有关的蛋白，经过细胞凋亡、死亡、裂解，其他非必需蛋白也可以释放到细胞培养基中。因此，宿主蛋白（HCP）蛋白残留是生物制品中非常关键的工艺相关杂质，可能影响产品的安全性和功效。美国药典规定HCP残留量1-100 ng/mg；中国药典各论中规定，CHO细胞HCP残留量不高于0.05% 。
酶联免疫法（ELISA）是药典规定的 HCP定量方式，但这个技术本身也具有局限性。如：ELISA试剂盒中抗体覆盖率只能达到50%-80%左右，不能覆盖所有的HCP种类；ELISA方法只能对总量进行测定，无法得到每种HCP的种类和含量信息。因此，国内外专家建议采用质谱法对HCP进行准确的鉴定和定量分析，与ELISA方法形成正交对照，对HCP种类和含量进行严格控制。
应用方向
质谱法HCP鉴定和定量分析主要用于以下几个方向：
生产工艺优化
如不同工艺路线的中间过程样品进行对比研究，分析每一步HCP的去除效率，进而筛选出最佳的工艺路线。由于ELISA方法只能检测总HCP含量，有些含量高但是免疫原性低（此处指抗体无法识别）的HCP就无法被有效监测，故建议在工艺开发的过程中，结合质谱的数据，更加准确地指导工艺优化。
终产品中HCP监控
对不同批次的原液进行横向对比分析，评估工艺路线的稳定性。同时与ELISA的检测数据进行对比，进一步明确HCP的残留情况，降低安全风险。
技术路线
01
目前常用的定量方法主要包括掺入蛋白标准品、标准肽段等方式，进行绝对定量分析（见图1）。
△图1. 质谱法HCP定量方法（来源于文献资料）
02
然后根据样品类型进行实验方法优化。以单抗为例，原液中HCP含量较低（一般在10-100ppm），可以采用Protein A富集或者非变性酶解的方式去除抗体成分。实验结果表明HCP的富集效率达到99%以上，显著降低动态范围，有助于低丰度蛋白的鉴定和定量分析（见图2）。根据样品的特性差异（HCP含量水平，主成分去除方法），可以选用DDA或者DIA等不同的质谱采集模式。
△图2. 质谱法HCP分析技术路线示意图（来源于文献资料）
03
最后是质谱数据分析，采用相应的物种数据库（如CHO细胞蛋白质数据库，毕赤酵母蛋白质数据库等）进行HCP鉴定和定量分析。图3是文献中对不同的商品化抗体药物进行HCP鉴定和定量分析，除了可以直观地看到各种HCP的种类和含量之外；还可以与ELISA数据进行对比分析，虽然两种技术路线的原理完全不同，但是各有优势和劣势。
△图3. HCP鉴定及定量结果示意图（来源于文献资料）
近几年国内外的监管机构对HCP残留的要求在不断提高；我们也与不同的客户合作，对多肽、单抗、重组蛋白、天然提取产物等不同类型的样品进行质谱法HCP鉴定和定量分析，积累了较为丰富的经验。期待为广大客户提供个性化定制产品服务。
