宿主细胞蛋白抗体覆盖率验证：双向凝胶电泳（2D-WB）
2023-09-28
中科新生命
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宿主细胞蛋白（HCP） 是什么？
HCP是指在生产治疗性蛋白质药物时，宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞）所产生的一种蛋白质混合物。这种混合物可能会残留在治疗性蛋白质药物产品中，具有潜在的免疫原性，因此可能会影响药物产品的质量、安全性和有效性。因此，对于HCP的去除水平需要建立合适的监测策略，并控制终产品中HCP的含量以符合药物质量的要求。
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宿主细胞蛋白（HCP）有什么危害？
HCP是生物制品中的非目标成分，即使其含量较低也可能会引发机体未知的免疫应答，从而影响生物制品的功效，并导致超敏反应或其他不良反应。此外，某些具有蛋白水解活性的HCP如果未充分去除或失活，也会影响药品的稳定性和功效。文献报道HCP的主要危害包括免疫原性、聚集、片段化、介质污染以及在水解制剂中的聚山梨酯80等。免疫原性抗体类产品中常见的宿主蛋白能引起免疫反应。在一个案例中，IB1001治疗B型血友病患者出血时，因HCP引发免疫反应而导致Ⅲ期临床试验暂停。因此，深入研究HCP的影响非常重要，前期需要使用正交方法来充分评估HCP。
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宿主细胞蛋白（HCP）有哪些法规要求？
宿主细胞蛋白（HCP）是生物制品中的一种杂质蛋白质，其存在可能对人体造成不良影响，因此HCP受到监管机构的严格监管。以下是HCP的相关法规要求：
国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南：ICH Q6B指出，需要根据ICH准则采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP，其残留量通常要求小于100ppm。
中国药典：2020年版中国药典三部各论中显示，HCP标准为占总蛋白含量要小于0.05%。
FDA法规：FDA要求用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCP，其含量应该低于检测限（通常小于100ppm）。
欧洲药典：欧洲药典中规定，在生物制品中，HCP的含量应当小于0.1%。
由此可见，监管机构对于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工艺开发必须经过HCP检测，并证明纯化工艺能够将HCP降低到安全水平，一般要求每毫克药物HCP应当控制在纳克范围内。
国际人用药品注册技术协调会（ICH）发布的指南ICH Q6B指出，HCP通常通过选用可检测广泛蛋白质杂质的方法进行检测，而免疫分析法因其高灵敏度和高通量而被广泛采用。夹心酶联免疫吸附法（ELISA）是行业标准，其开发过程包括向动物体内注射HCP混合物以引发免疫反应，并使用多克隆抗体开发多分析物夹心ELISA试剂盒。
尽管多克隆抗体可以识别大多数HCP混合物中的蛋白质，但在某些特定制造过程中可能无法检测到特定的HCP成分。因此，在商业化申报之前，监管机构要求治疗性蛋白产品的多克隆抗体必须经过验证，以确保其对产品中HCP能被检测抗体结合。ELISA法的准确性主要取决于多克隆抗体对HCP的覆盖率。
免疫亲和纯化、2-D凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验（Western Blotting）是表征HCP ELISA抗体及其覆盖率的推荐方法。(《美国药典》1132和《欧洲药典》2.6.34)
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双向凝胶电泳联用免疫印迹分析
（2-D SDS-PAGE/Western blot, 2D-WB）
双向凝胶电泳是唯一能同时将上千种蛋白质分离和展示的方法，在蛋白质组学中发挥着重要作用。传统的双向凝胶电泳连用免疫印迹分析，如技术路线1所示：
由于整个流程涉及到两块双向电泳凝胶的蛋白分离、银染、转膜和免疫印迹，人为操作较多，且两块双向电泳凝胶的配制本身存在的一定的误差，因此软件图谱重叠难度较大，覆盖率一般不高。
后来在技术路线1的基础上，逐渐出现了改进的2D-WB的方法，如技术路线2所示：
用一块双向电泳凝胶完成HCP分离后，通过转膜将HCP转移到PVDF膜上，进行SYPRO Ruby荧光染色，获得HCP荧光染色图谱。再通过杂交抗体结合HCP蛋白，进行免疫荧光检测，获得抗体结合的HCP免疫印迹图谱。由于两张图基于同一块PVDF膜，规避了双向电泳带来的系统误差，使得软件能更好的进行图谱重叠，更精准的蛋白点识别和匹配，并计算抗体覆盖率。
总蛋白点数=荧光染色图谱点数+免疫印迹图谱点数-重合点数
抗体覆盖率= 免疫印迹图谱点数/总蛋白点数×100%
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中科新生命HCP抗体覆盖率验证服务介绍
上海中科新生命生物科技有限公司（APTBIO）成立于2004年7月，前身为中国最早从事蛋白质组学研究的上海生命科学研究院蛋白质研究分析中心。该技术平台早在 2005和2006年就与Cytiva（原GE Healthcare）联合举办了第一届和第二届双向凝胶电泳和DIGE技术培训班，具有近20年的双向电泳技术服务经验。
近年来随着生物药的兴起，尤其是抗体药的IND和BLA进程加速。APTBIO协助国内2000+家企业进行了生物药物的结构表征确证工作，其中就包含了非常关键的HCP抗体覆盖率验证。APTBIO目前已完成的HCP抗体覆盖率验证项目涉及到了主流品牌的商业化ELISA试剂盒抗体和委托单位自研抗体，积累和总结了大量的样品前制备、双向电泳方法优化以及免疫印迹的经验，是深受广大客户信任的药物研发服务供应商。
下图展示的是APTBIO典型的HCP抗体覆盖率验证案例，该项目分析了主流品牌的HCP ELISA试剂盒内的HCP检测抗体对样品HCP的覆盖率。
▲经软件匹配计算，该抗体的HCP覆盖率高达80%以上，满足申报要求。
但是即便是改进后的2D-WB方法，也存在一定的局限性，比如：
凝胶载量导致检测的动态范围较窄
变性样品制备导致抗体识别表位被破坏
某些HCP在转膜过程中丢失
转膜导致某些抗体结合表位被封闭
非特异结合
在更多项目中，2D-WB所得到的覆盖率一般在50-60%之间，可满足早期IND申报要求。但对于BLA阶段，近年来随着监管机构的要求趋严，HCP抗体覆盖率略低，对药物上市申报会产生风险。
瑕不掩瑜，2D-WB还是一项实验流程简单、较低成本的HCP覆盖率检测方法。在药物研发的非临床阶段，可以帮助企业快速筛选商业化HCP检测试剂盒和初步评估自研抗体覆盖率。
至于该方法存在的问题，下次给大家介绍第一种基于免疫亲富集联用2D电泳技术的HCP抗体覆盖率验证方法，该方法规避了2D-WB方法的弊端，可更客观的反映出检测抗体的HCP覆盖率，敬请期待！
