Adv Sci | 单细胞+乳酸化+铁死亡的“王炸”组合!海军军医大学史建刚团队新作揭示IVDD进展的分子机制

临床髓核组织、人髓核细胞、IVDD相关动物模型

为了全面探讨IVDD期间NPC的葡萄糖代谢变化，作者检索了已发表的包含来自不同程度退化患者的椎间盘组织单细胞转录数据，并确定了代表不同细胞类型的16个簇。对其中的NPC进行再分群，获得7个NPC亚群。使用拟时序重建了NPCs谱系的分化轨迹，发现椎间盘退化的整体分化轨迹是从稳态 NPC开始，向纤维化和肥大性NPC分支来建立的。此外，作者分析了NPCs在IVDD期间不断增加或减少的差异表达基因，并将它们根据其表达模式进行聚类，可分为四个模块。模块1和2在疾病的后期上调，模块3和4在疾病早期上调。GO和KEGG分析显示，模块1与IVDD的病理变化有关，包括糖酵解、铁死亡等，证明能量代谢紊乱可能是IVDD期间稳态NPC表型转变为纤维化NPC的先决条件。

作者构建了各生物学途径的评分以评估疾病进展与生物学功能的关系。发现在椎间盘变性过程中，糖酵解评分升高，氧化磷酸化评分降低。这些结果表明，细胞代谢从氧化磷酸化到糖酵解的转变与IVDD进展有关。

首先在临床椎间盘髓核组织上评估了糖酵解蛋白的表达，发现NP组织中HK2、G6PD和LDHA的表达随着IVDD的严重程度而增加。此外，NP组织中乳酸含量也与Pfirrmann分级呈正相关。IVDD小鼠模型中，NP组织的乳酸含量随着退化而逐渐增加。这些结果表明，在IVDD期间糖酵解被过度激活。

异常的炎症反应是IVDD的一个关键特征。转录组测序和免疫荧光染色结果表明，IL-1β处理NPC，可显著上调糖酵解相关基因/蛋白的表达。细胞的外酸化率和耗氧率同样证明，IL-1β处理明显增加了细胞的糖酵解并抑制了线粒体呼吸。这些结果表明，在炎症触发的变性过程中，NPC从有氧代谢转变为厌氧代谢。

细胞活力实验表明，随着乳酸浓度的升高，NPC细胞的活力明显降低，且IVDD相关基因的表达明显变化。此外，乳酸可促进NPC中的ECM降解、降低线粒体膜电位、损害线粒体嵴完整性。

IVDD小鼠模型中，H&E和SOFG染色均显示乳酸的注射进一步加重了IVDD。总而言之，IVD微环境中乳酸的过量产生和积累可能会引发NPC功能障碍并加重IVDD。

为了探讨NPC中乳酸的调节机制，用乳酸处理NPC。转录组的GSEA分析表明，铁死亡在乳酸处理的NPC中显着富集。体外试验发现，乳酸的给药导致脂质过氧化 、线粒体活性氧和Fe积累在NPC中的增加，而铁死亡抑制剂可抑制铁死亡相关表型。上述结果表明，乳酸的过度积累增加了NPC对铁死亡的易感性。

单细胞转录分析了乳酸处理和非处理的NPC，可将NPC分为四个不同的簇。在四个NPC亚型中，铁死亡驱动因子都被激活，铁死亡抑制因子被抑制。整合bulk转录组和单细胞转录的结果，进一步证明了乳酸激活NPC中的铁死亡。

脂质过氧化的关键启动子ACSL4 mRNA在乳酸诱导的NPC中被显著上调，沉默ACSL4恢复了乳酸诱导NPC中的铁死亡表型，预示ACSL4相关途径是乳酸激活铁死亡的重要步骤。

为了研究乳酸是否通过组蛋白乳酸化调节ACSL4的转录，作者使用乳酸转移酶p300/CBP抑制剂处理NPC，发现ACSL4转录本的显著降低。随后对组蛋白的乳酸化修饰水平进行测定，其中H3K18乳酸化的增加受p300/CBP抑制剂处理后的变化最为显着。CUT&TAG分析证明ACSL4启动子处的H3K18la水平升高。综上所述，乳酸通过升高H3K18la水平增加了ACSL4的转录水平。

乳酸除了乳酸化调节H3K18上调ACSL4的转录之外，是否直接乳酸化调节ACSL4的功能仍然未知。乳酸处理NPC后，使用ACSL4抗体捕获ACSL4并进行质谱分析，鉴定到其K412可能是潜在的乳酸化修饰位点。细胞试验发现，相比于过表达WT ACSL4，过表达ACSL4 K412突变的NPC显示出较低的乳酸化水平。抑制乳酸的跨膜转运同样降低了ACSL4的乳酸化修饰水平，进而影响ACSL4的二聚化及酶活。

此外，ACSL4 K412突变的NPC在有/无乳酸处理的情况下，铁死亡途径被部分缓解。这些结果表明，除了增加ACSL4的mRNA表达外，乳酸还可以通过乳酸化增强ACSL4的活性来激活铁死亡。

乳酸化修饰除了受乳酸转移酶（writer蛋白）调节外，也受eraser蛋白的调控。通过co-IP试验及多组学结果，作者确定了SIRT3是唯一可被乳酸负调控的eraser蛋白。反向co-IP和免疫荧光共定位进一步确定了ACSL4和SIRT3之间的互作。沉默SIRT3可进一步增加乳酸诱导的ACSL4表达和乳酸化修饰，而增强SIRT3表达可显著减轻这些影响。

为了研究乳酸调控SIRT3的机制，作者基于多个数据库交叉确定了靶向SIRT3 mRNA 3′-UTR 的潜在miRNA。结合乳酸处理/非处理NPC的RT-qPCR结果，证明miR-708-5p是乳酸调节 SIRT3 的潜在桥梁。

鉴于糖酵解衍生的乳酸对 NPC 变性的促进作用，作者在小鼠模型中研究了糖酵解抑制对IVDD的潜在治疗作用。结果显示，干预LDHA表达或使用糖酵解抑制剂2-DG后，椎间盘高度指数增加、组织学损伤显著改善。此外，抑制LDHA的表达显着抑制了NP组织内模型处理诱导的整体乳酸化修饰水平、铁死亡标志物和ACSL4表达水平。

总的来说，通过基因沉默或化学处理抑制糖酵解可以抑制乳酸的产生和乳酸化修饰，从而显着改善IVDD期间的铁死亡激活和NPC功能障碍。

本研究基于单细胞转录的数据，首次阐明乳酸通过“表观遗传调控-蛋白修饰”双途径激活铁死亡的分子机制，证明了：1）IVDD期间NPC的特征是糖酵解显着增加和氧化磷酸化减少；2）乳酸通过促进 H3K18la介导的ACSL4转录和乳酸化导致NPC铁死亡和功能障碍；3）通过基因沉默或化学手段抑制糖酵解，可降低NPC乳酸化水平和铁死亡，以减轻IVDD。这些结果为IVDD的治疗提供了新靶点。