NC署名文章 | 一份样本五大组学！中山大学团队蛋白基因组临床队列研究揭示局限性前列腺癌分子分型特征

145例中国PCa患者的肿瘤和非肿瘤配对组织

作者利用145名中国PCa患者的配对肿瘤和非肿瘤前列腺组织，进行多组学分析：蛋白组学、磷酸化修饰组学、全外显子测序、转录组测序（图1A）。基于数据非依赖型采集（DIA）蛋白质组学的结果，共鉴定出8694个蛋白质及26000多个磷酸化位点。基于非负矩阵分解（NMF）方法进行无监督聚类分析，蛋白质组学水平上145名患者被分为三个不同的亚组（图1B）。且与前期研究一致，PCa的转录组学和蛋白质组学亚型之间存在轻度重叠（15-18%）（图1C）。代谢途径富集有两个亚组，其中代谢亚组2预后较差，且与AR信号通路高度相关（图1F-G）。另一组通过基因集富集分析（GSEA）显示富集免疫相关通路（图1D）。

作者对三个亚组进行基因组、转录组和磷酸化蛋白质组学分析（图1A）。有趣的是，与亚组3相比，代谢相关亚组1和2表现出显著更高的肿瘤突变负荷（TMB）和体细胞拷贝数畸变（SCNA）负荷（图2A），表明基因组不稳定性增加与预后变差之间存在关联。基因突变分析表明，FOXA1作为增强AE转录激活的先锋转录因子，在代谢亚组2中表现出显著更高的表达（P=0.015）（图2B）。代谢亚组2患者表现出较高的肿瘤抑制基因缺失（RB1，CHD1和ZNF292），代谢亚组1与脂质代谢功能有关（图2C）。激酶-基底富集分析（KSEA）说明细胞周期调节激酶（UHMK1，CHEK1）和AR途径的靶激酶CAMKK225在代谢亚组2中显著富集（图2D）。多组学分析解释AR通路在亚组2患者中被激活，与其他亚组相比，预后最差。而亚组1表现出较高的脂质代谢，亚组3表现出免疫热点特征。

亚组被特定的富集到多个糖和糖原代谢相关途径，尤其是氨基糖和核苷酸糖代谢途径（图3A）代谢亚组2中几种唾液酸合成相关酶显著上调（UAP1、NPL和NANS）（图3B）。 H650高通量靶向代谢组学分析显示亚组2中唾液酸代谢途径的终产物N-乙酰神经氨酸的显著上调（图3C）。从其他中心收集到的119例PCa患者（验证队列1）根据蛋白组学亚型可成功分为三个蛋白质组学亚组，与发现队列中确定的蛋白质组一致（图3D）。重要的是，蛋白质组学亚组2表现为较高的唾液酸合成代谢，在验证队列1（图3D-E）中预后最差。

NANS在唾液酸合成途径中起关键作用，肿瘤组织与临近组织相比，蛋白数据表现出NANS 的显著升高，尤其是在亚组2中（图3F），这一结论通过免疫组织化学（IHC）染色在发现队列中NANS的免疫组化染色（IHS）和验证队列1的蛋白组数据中得到证实（图3G-H）。生存分析显示，较高NANS表达与生化无复发生存期缩短之间的显著相关性（P=0.0054）（图3I）。作者从另一个中心招募了100名PCa患者作为验证队列2并进行了NANS的IHC染色。两个验证队列的生存分析均证实，较高的NANS表达与PCa的不良预后相关（图3J-K）。

为了解唾液酸合成异常是否导致亚组2中肿瘤唾液酸化的变化，在发现队列中对肿瘤组织中α2,3和α2,6-唾液酸化进行IHC染色。与其他两个亚组相比，亚组2肿瘤的唾液酸化显著增加（图4A）。作者采用了一组8个PCa细胞系（通过NTP算法分为三个蛋白组学亚型）（图4B）。人源性22Rv1和小鼠Myc-CaP PCa细胞均被归类为侵袭性亚组2。作者进一步使用22Rv1和Myc-CaP细胞进行体外实验，根据sgRNA构建Nans敲除的PCa细胞（图4C-D）。结果表明，NANS耗竭在很大程度上减少了唾液酸合成（图4E），并伴有肿瘤细胞的唾液酸化水平降低（图4F）。

为了揭示PCa的免疫微环境，在发现队列中进行了EcoTyper分析，结果显示亚组2中巨噬细胞浸润增加（图4G）。多重免疫荧光染色（mIF）进一步证实了免疫抑制微环境，亚组2中M2型巨噬细胞浸润增加，CD8+ T细胞浸润减少（图4H）。这些结果表明，亚组2中的PCa患者表现出唾液酸化相关的免疫抑制微环境。

作者构建了PCa原位移植小鼠模型（Myc-CaP细胞存在/敲除Nans）。肿瘤细胞接种后4周，收集两组肿瘤组织并进行蛋白质组学分析和单细胞转录组测序（scRNA-seq）。单细胞转录组数据显示得到10个细胞群（图5A）。上皮细胞分为4个主要亚群（图5B）。Nans耗竭后，上皮细胞C1亚群显著减少，其表现出恶性进展相关通路和唾液酸相关通路的激活（p<0.0001，图5C-D），在Nans敲除组中也观察到巨噬细胞的显著减少（p<0.0001，图5E）。作者进一步鉴定了巨噬细胞的四个亚群，只有Lyve1+巨噬细胞的比例在Nans耗竭后显著下降（p<0.0001，图5F-G），且唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1（Siglec1）的表达最高（图5H）。功能富集分析表明，Lyve1+巨噬细胞主要表现出M2样表型和免疫抑制状态（图5I）。IF结果证实，Nans耗竭显著减轻了肿瘤唾液酸化水平，减少了M2型巨噬细胞浸润，增加了肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润（图5J）。Nans缺陷导致原位移植小鼠模型中肿瘤生长延迟（图5K），肿瘤体积和重量减少（图5L）。

该研究采用转录组、外显子测序、蛋白组学、磷酸化修饰组对PCa队列配对肿瘤和癌旁组织进行多组学检测，并通过两个外部队列进行验证。结合蛋白分型结果，作者构建细胞来源的Nans敲除模型，并通过单细胞转录组探究肿瘤免疫微环境改变。该文章集成了多组学数据以细化定位PCa的分子亚型，并将NANS确定为侵袭性PCa的潜在预后生物标志物和治疗选择。