干货分享 | 人胰岛素及其类似物的分析方法综述(一)

人胰岛素由 A、B 两条链组成，共有 51 个氨基酸，其中 A 链有 21 个氨基酸，B 链有 30 个氨基酸。两条链通过两个二硫键连接，A 链内部还有一个二硫键。

胰岛素的三维结构对于其生物学功能至关重要。它的结构特点决定了它与受体的结合方式以及后续的信号传导过程。

胰岛素类似物通常是通过对人胰岛素的氨基酸序列进行修饰而得到的。这些修饰可以改变胰岛素的药代动力学和生物学效应。

例如，甘精胰岛素在 A 链的 21 位门冬酰胺由甘氨酸代替，在 B 链的 C 末端增加了 2 个额外氨基酸，精氨酸（B₃₁）和精氨酸（B₃₂）。门冬胰岛素是将人胰岛素 B 链第 28 位的脯氨酸替换为天冬氨酸，赖脯胰岛素是将人胰岛素 B 链第 28 位和第 29 位的脯氨酸和赖氨酸的位置互换。

方法原理

LC - MS/MS 结合了液相色谱的分离能力和质谱的鉴定能力。液相色谱可以将复杂的样品进行分离，然后质谱可以对分离后的组分进行分子量和结构的鉴定。

在人胰岛素及其类似物的分析中，通常采用反相液相色谱柱，流动相为水和乙腈的混合物，并添加甲酸等调节剂来改善分离效果和离子化效率。

应用实例

胡馨月等人建立了采用超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC - MS/MS）测定人胰岛素及其类似物全序列的方法。该方法以人胰岛素为主要研究对象，首先对其进行还原烷基化前处理，后进行 UPLC - MS/MS 分析。采用 ACQUITY UPLC peptide BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7μm，300Å）色谱柱，流动相 A 为 0.1% 甲酸 / 水溶液，流动相 B 为 0.1% 甲酸 / 乙腈溶液，梯度洗脱。通过优化质谱参数，对人胰岛素及其类似物进行 “top - town” 全序列的测定分析。

该方法能够较好地覆盖人胰岛素 A 和 B 链的全序列，通过 b/y 离子分析，5 个高强度 b/y 离子的离子强度 RSD 在 20% 之内，A 链与 B 链一级质量数准确，其精密度、准确度良好；该方法可区分与其他胰岛素类似物的序列的不同，专属性良好，且对门冬胰岛素和赖脯胰岛素具有良好的适用性。

方法原理

肽图分析是通过酶解或化学裂解将蛋白质分解成肽段，然后通过液相色谱或其他方法对肽段进行分离和分析。通过比较肽图可以确定蛋白质的结构和序列是否正确。

应用实例

王绿音等人研究了甘精胰岛素肽图分析方法。通过特定的酶解条件将甘精胰岛素分解成肽段，然后采用液相色谱进行分离和分析。通过与标准品的肽图比较，可以检测甘精胰岛素的结构是否正确，以及是否存在杂质或降解产物。

方法原理

RP - HPLC 是基于溶质在固定相和流动相之间的分配系数差异进行分离的。在人胰岛素及其类似物的有关物质分析中，通常采用 C₁₈色谱柱，流动相为缓冲液和有机溶剂的混合物。

应用实例

丁晓丽等人优化了甘精胰岛素注射液有关物质分析方法。采用 Thermo scientific Bio - Basic - C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以氯化钠 - 磷酸盐缓冲液 - 乙腈（18.4 g∶250 mL∶250 mL，加水至 1000 mL）为流动相 A，氯化钠 - 磷酸盐缓冲液 - 乙腈（3.2 g∶250 mL∶650 mL，加水至 1000 mL）为流动相 B，梯度洗脱，流速 1.0 mL・min⁻¹，检测波长 214 nm 柱温 35℃。

该方法学验证结果良好，能够有效分离并准确测定样品中的有关物质。经鉴定，甘精胰岛素注射液的主要有关物质为 B 链第 3 位天冬酰胺的脱 NH₃降解产物，即 3B - 琥珀酰亚胺 - 甘精胰岛素。

方法原理

LC - MS 技术可以在分离有关物质的同时对其进行结构鉴定。通过对质谱数据的分析，可以确定有关物质的分子量和可能的结构。

应用实例

在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，利用 RP - HPLC 方法收集含量最大有关物质组分并利用 LC - MS 方法进行鉴别。分析色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C₁₈Column（100 mm×2.1 mm，1.7μm，300Å），以 0.1% 甲酸水溶液为流动相 A，0.1% 甲酸乙腈溶液为流动相 B，进行梯度洗脱，柱温为 50℃。质谱数据采集条件为 MSE 模式，一级质谱能量 40V。通过 LC - MS 分析确定了主要有关物质为 3B - 琥珀酰亚胺 - 甘精胰岛素。