干货分享 | iCIEF（毛细管等电聚焦电泳）：蛋白质电荷异构体分析

iCIEF（毛细管等电聚焦电泳）是一种用于分析蛋白质电荷异构体的高效技术。通过iCIEF，研究者可以精确地分离和鉴定具有不同等电点（pI）的蛋白质或肽段。本文将介绍iCIEF的检测原理、与IEC（离子交换色谱）的区别、应用、样本处理、分析流程和蛋白电荷异构体峰的鉴定。

 

一、iCIEF检测原理

 

iCIEF利用毛细管等电聚焦技术，通过在毛细管中建立稳定的pH梯度，使蛋白质在电场作用下迁移到其等电点位置并聚焦成锐利的带。在达到等电点时，蛋白质的净电荷为零，迁移速率减慢，从而实现不同电荷异构体的分离。

iCIEF和IEC都是用于分离蛋白质的电荷异构体的技术，但它们在分离机制和应用方面有所不同：

1.分离机制：iCIEF基于蛋白质的等电点分离，而IEC基于蛋白质的电荷强度分离。

2.分辨率：iCIEF通常提供比IEC更高的分辨率，能够分离非常接近的等电点的异构体。

3.样本量：iCIEF适用于微量样本分析，而IEC通常用于较大体积的样本。

 

二、iCIEF应用

 

iCIEF在生物制药领域具有广泛的应用。它是一种重要的蛋白质表征技术，常用于分析蛋白质药物的电荷异构体分布。通过iCIEF，研究者可以评估蛋白质制品中的电荷异构体纯度，从而确保产品的一致性和质量。

在蛋白质药物开发过程中，iCIEF被用于表征蛋白质的等电点和电荷异构体分布。这对于理解蛋白质的结构和功能特性至关重要。通过分析蛋白质在不同条件下的电荷变化，可以揭示蛋白质的稳定性和折叠状态。

此外，iCIEF在比较生物相似性方面也发挥着重要作用。在生物仿制药的开发中，iCIEF被用于比较生物仿制药和原研药之间的电荷异构体分布。这有助于证明生物仿制药的结构和功能与原研药的相似性，从而支持生物仿制药的上市申请。

iCIEF还被应用于监测蛋白质药物生产过程中的变异和杂质。通过定期分析蛋白质药物的电荷异构体分布，可以及时发现生产过程中可能出现的问题，确保产品的质量控制。

 

三、iCIEF设备

 

毛细管等电聚焦仪（Maurice C.）：检测范围宽：2.85-10.45PI；检测时间短：10-15分钟；样品盘4℃、10℃、15℃精确控温；可放置96孔板或48进样瓶，高通量自动运行；全柱像扫描，利于观测样品聚焦过程。

 

Maurice C

 

四、iCIEF样本处理

 

iCIEF样本处理通常包括：

1.样品稀释：将蛋白质样品稀释至适合iCIEF分析的浓度。

2.缓冲液选择：选择适合蛋白质稳定性的缓冲液，以维持蛋白质的三维结构。

3.样品加载：将处理好的样品加载到毛细管中进行分析。

 

五、iCIEF实验流程

 

步骤	描述
毛细管填充	将毛细管填充适合蛋白质的背景电解质。
建立pH梯度	使用两种pH值不同的电解质，在毛细管两端产生稳定的pH梯度。
样品注入	将蛋白质样品注入毛细管中。
聚焦	通电使蛋白质在pH梯度中迁移到等电点并聚焦成带。
检测	通过紫外或荧光检测器检测聚焦的蛋白质带。
数据分析	分析检测到的蛋白质带的位置和强度，确定蛋白质的等电点和相对丰度。

 

 

 

 

 

六、iCIEF的结果示例图

 

供试品1

供试品2

七、电荷异构体峰的鉴定

 

在iCIEF分析中，蛋白电荷异构体峰的鉴定通常涉及以下几个方面：

1.峰识别

在iCIEF分析的洗脱图谱中，不同的蛋白电荷异构体会在不同的位置聚焦形成独立的峰。通过观察图谱中的峰形和位置，可以初步识别出不同的电荷异构体。

2.等电点（pI）确定

根据蛋白质在pH梯度中聚焦的位置，可以估算出蛋白电荷异构体的等电点（pI）。这是通过比较样品峰的位置与已知pI标准品的位置来实现的。

3.峰强度分析

通过分析不同峰的强度，可以评估各个电荷异构体在样品中的相对丰度。这对于评估蛋白质制品的纯度和均一性非常重要。

4.峰形分析

对峰形的分析可以提供有关蛋白质异构体聚集状态和稳定性的信息。尖锐、对称的峰通常表示蛋白质异构体较为纯净且稳定。

5.确认和验证

对于未知的蛋白电荷异构体峰，可能需要进一步的实验来确认其身份，例如通过质谱分析或蛋白质序列分析等方法。在某些情况下，也可以使用特异性的生化方法或抗体来验证特定异构体的存在。

通过上述步骤，iCIEF可以有效地鉴定蛋白质样品中的电荷异构体峰，为蛋白质的表征和分析提供重要信息。

八、iCIEF关键优势

iCIEF在分析蛋白质电荷异构体和蛋白质药物表征方面具备几个关键优势：

1.   高分辨率：iCIEF能够分辨非常接近的等电点（pI）的蛋白质异构体，提供了高分辨率的蛋白质电荷分析。

2.   快速分析：与传统的等电聚焦电泳（IEF）相比，iCIEF具有更快的分析速度，通常在几十分钟内就能完成一次分析。

3.   自动化操作：iCIEF可以实现高度自动化的操作，减少人为误差，提高分析的重复性和准确性。

4.   微量样本分析：iCIEF仅需要微量的样本就能进行分析，适用于珍贵或有限的蛋白质样品。

5.   兼容性：iCIEF可以与其他分析技术（如质谱）结合使用，提供更全面的蛋白质表征信息。

6.   适用性广泛：iCIEF适用于多种类型的蛋白质样品，包括单克隆抗体、融合蛋白、疫苗等蛋白质药物的表征。

7.   定量分析：iCIEF不仅能定性分析蛋白质电荷异构体，还能进行定量分析，评估不同异构体的相对丰度。

 

这些优势使iCIEF成为蛋白质药物开发和质量控制中不可或缺的分析工具，特别是在评估蛋白质药物的电荷异构体纯度和均一性方面发挥着重要作用。