Nat Commun | 中山大学揭秘“隐匿杀手”鼻咽癌TLS关键成分，双重提升患者预后与免疫治疗响应！

scRNA-seq有77份活检和血液样本；

Stereo-seq空转3份NPC新鲜冷冻样本；

10x Visium空转12份NPC石蜡样本。

鉴于CD20⁺ 滤泡B细胞与CD3⁺T细胞聚集是多种癌症TLS的标志，通过免疫组化(IHC)分析，在鼻咽癌中发现TLSs，包括B细胞(CD20作为标志)，CD4⁺ T细胞(CD3, CD4)，CD8⁺ T细胞(CD3, CD8)和成纤维细胞(FAP-α)。通过scRNA-seq鉴定343,829个细胞，根据典型的TLS特征鉴定TLS相关的细胞群，包括B细胞、T滤泡辅助细胞(Tfh)细胞、CD8⁺ T细胞和CAFs。

通过10x Visium和stereo-seq空间转录组(ST)分析，确认NPC肿瘤的TLS、肿瘤细胞聚集体(TCA)和不规则形状的间质区域的位置不同。同时，ST分析证实B细胞(Naïve B,Memory B, GC B和浆细胞)，CD4_C8_CXCR5和CD8_C8_CXCL13 T细胞，以及CXCL13⁺CAFs (iCAF_C2_CXCL13)在NPC肿瘤TLS区域的聚集，综上，鼻咽癌中TLS存在B细胞(Naïve B, Memory B, GC B和浆细胞)，CD4_C8_CXCR5和CD8_C8_CXCL13 T细胞，及CXCL13⁺ CAFs共同的空间定位。

与PBMC相比，在NPC组织的B细胞中观察到IGHA1、IGHG1和IGHG3更高的体细胞超突变(SHM)频率，且占比更高，反映与抗原识别和激活相关的BCR更高的亲和力。DEG分析显示，不同B细胞类型的特征基因表达不同，与先前报道的内容一致，这些发现共同表明，浸润肿瘤的B细胞可能通过GC反应、亲和成熟和鼻咽癌TME中的抗体类别转换进行生产激活。

scRNA-seq和Bulk RNA-seq结果显示晚期鼻咽癌(III/IV)比早期(I/II) GC B细胞明显降低，但不同阶段的鼻咽癌浆细胞的比例相似，在晚期鼻咽癌肿瘤中，相同的BCR克隆型在GC B和浆细胞之间的转移显著减少，pan-Ig转录水平明显降低，浆细胞中BCR信号传导、肽生物合成过程和蛋白质运输等多个通路的基因下调，结合ST结果和生存分析，表明浆细胞的抗体生成功能在晚期肿瘤中受到抑制，较高的GC B细胞占比和pan-Ig转录水平均与较好的鼻咽癌预后相关。

Bulk RNA-seq的肿瘤或外周血样本中，高EBV载量的鼻咽癌患者的肿瘤浆细胞中的pan-Ig转录低于低EBV载量的患者，评估ST数据发现，高EBV TCA与浆细胞占比呈负相关，有浆细胞的TCA (TCA-wP)比没有浆细胞(TCA-woP)具有更高的凋亡特征。细胞-细胞相互作用分析显示EBV⁺ (LMP1)鼻咽癌恶性细胞通过CCL2-CCR2与浆细胞相互作用，表明EBV⁺ NPC恶性细胞可能通过CCL2-CCR2轴吸引浆细胞。

为探索浆细胞产生的抗体在免疫治疗中的潜在作用，作者对12名NPC患者进行抗PD1免疫检查点阻断(ICB)治疗，发现应答者肿瘤pan-Ig表达水平更高，浆细胞浸润点更多，TCA-wP比例也更高，尤其是高EBV-TCA-wP，凋亡特征明显高于无应答者，表明浆细胞促进EBV高恶性细胞的凋亡也有助于鼻咽癌的ICB治疗反应，可能是通过ICB逆转EBV高恶性细胞免疫抑制的能力介导的。

CXCL13⁺ CAFs高表达与B淋巴细胞的激活和粘附相关基因，富集“B细胞趋化”、“生发中心形成”和“C3和C5激活”等参与GC形成和B细胞的迁移和激活通路，从早期NPC到晚期NPC，类似于GC B细胞和抗体水平下降，CXCL13⁺ CAFs比例也呈下降趋势。ST表明，CXCL13⁺ CAFs位于TLS内，综上，CXCL13⁺ CAFs可能与鼻咽癌TLS中B细胞的GC形成和抗体产生有关。细胞-细胞互作分析显示，CXCL13⁺ CAFs通过一些配体受体对与B细胞相互作用，促进B细胞趋化、粘附和激活。为验证CXCL13⁺ CAFs对B细胞的作用，体外共培养表明CXCL13⁺成纤维细胞通过CXCL13^- CXCR5轴募集B细胞。

相比对照组，过表达TNFSF13B的成纤维细胞共培养的B细胞IgG产量显著增加，中和TNFSF13B抗体后，由于TNFSF13B过表达而增加的B细胞IgG被显著消除，证实了CXCL13⁺ TLS相关的CAFs通过TNFSF13B信号传导促进抗体的产生。此外，生存分析显示，较高比例的CXCL13⁺ CAFs且高表达IgG与鼻咽癌预后较好相关。这些观察结果表明CXCL13⁺ CAFs与B细胞相互作用并介导其产生抗体，从而促进鼻咽癌患者更好的生存。

TLS相关CD8_C8_CXCL13高表达一些活化T细胞、干细胞样、趋化因子和toll样受体marker，但不表达其他耗竭分子，GSVA分析表明其没有耗竭特征。伪时间轨迹分析揭示从CD8_C8_CXCL13到CD8_C11_HAVCR2发育路径，衰竭评分呈上升趋势，而干细胞样评分呈下降趋势，TCR共享分析显示，两者拥有最多的TCR克隆型。ST分析显示，CD8_C8_CXCL13 T细胞在TLS中显著富集，而CD8_C11_HAVCR2 T细胞则在TCA中富集。表明随着鼻咽癌干性和TCR多样性的降低，从TLS中的CD8_C8_CXCL13细胞到耗竭的CD8_C11_HAVCR2细胞广泛传播到TCA的发育轨迹。在鼻咽癌TCA中，CD8_C8_CXCL13细胞可能比耗竭的CD8⁺ T细胞更积极地募集到TLS，并具有更大的抗肿瘤潜力。

基于scRNA-seq数据的TLS相关细胞的转录特征，评估TLS相关细胞类型在三个独立NPC队列中的比例与预后联系，发现预后与7种TLS相关细胞类型（Naïve B、Memory B、GC B、浆细胞、CD4_C8_CXCR5、CD8_C8_CXCL13 T细胞和CXCL13⁺ CAFs）的比例强相关，且细胞比例越高生存率越好。此外，多变量Cox回归分析发现，TLS是独立的作为鼻咽癌生存的预后指标。综上，七种细胞TLSs的形成有助于鼻咽癌患者的预后和免疫治疗反应。