项目文章Drug Resist Update | 南方医院谭万龙团队揭示RIPK1的O糖基化调控肾癌舒尼替尼耐药性机制

首先作者在裸鼠中建立RCC异种移植瘤模型，并通过舒尼替尼处理建立了舒尼替尼耐药和敏感模型。分别提取肿瘤组织进行非靶向代谢组学检测，PCA分析显示两组之间的代谢特征显着改变。舒尼替尼耐药组中己糖胺生物合成途径（HBP）途径相关代谢物UDP-GlcNAc和GlcN-6-P的水平显著高于舒尼替尼敏感组。而UDP-GlcNAc作为 O-GlcNAc糖基化修饰的供体底物，参与多种蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰，发挥生物学功能。因此考虑肾细胞癌舒尼替尼耐药的产生与O-GlcNAc糖基化修饰密切相关。基于此作者利用O-GlcNAc糖基化修饰泛抗体对肿瘤组织进行了Western blot 和IHC检测，结果表明舒尼替尼耐药组的O-GlcNAc糖基化修饰信号较敏感组显著上调。同时作者构建了舒尼替尼耐药的RCC细胞系（Caki-1-R、ACHN-R 和 786O-R）与敏感组相比IC50值及O-GlcNAc糖基化水平均更高。证明了O-GlcNAc糖基化可能在舒尼替尼耐药的发展中起作用。为了研究O-GlcNAc糖基化在舒尼替尼敏感性中的关键作用，作者使用小分子抑制剂OSMI-1抑制整体O-GlcNAc糖基化水平，结果增强了舒尼替尼在肾细胞癌中的诱导凋亡作用。体内异种移植实验也表明舒尼替尼联合 O-GlcNAc糖基化抑制剂治疗RCC效果更佳，细胞凋亡率更高。

为了更深入地研究O-GlcNAc糖基化调节RCC舒尼替尼敏感性的机制，作者重点研究了两种关键调节动态O-GlcNAc糖基化修饰周期的酶：O-GlcNAc转移酶 (OGT) 和 GlcNAcase (OGA)。IHC检测显示，在舒尼替尼耐药组中，RCC细胞显示出更高的OGT表达。随后，发现敲低OGT可提高肾细胞癌对舒尼替尼的敏感性。为进一步探究分子机制，作者利用CoIP-MS鉴定与OGT的互作蛋白。结果显示RIPK1丰度最高，定位于胞质。且通过进一步实验及O-GlcNAc糖基化修饰鉴定表明OGT 与RIPK1的特异性相互作用能够使RIPK1的O-GlcNAc糖基化修饰显著上调。为了鉴定OGT与RIPK1相互作用的结合域，作者构建了OGT和RIPK1的全长截断实验，CoIP 测定显示RIPK1 的TRP段和中间 (ID) 结构域对于与 OGT 的相互作用至关重要。在线数据库预测、点突变实验及Sanger 测序也验证OGT介导的Ser 331, Ser 440 和 Ser 669 为RIPK1的O-GlcNAc糖基化位点，三个位点同时突变后，RIPK1 O-GlcNAc糖基化显著降低，从而抑制舒尼替尼诱导的RCC细胞凋亡。

O-GlcNAc糖基化修饰可调节蛋白质功能、蛋白质-蛋白质相互作用和酶活性，而RIPK1通过NF-κB激活来决定细胞是否经历 RDA 或存活。作者进一步研究了RIPK1的O-GlcNAc糖基化是否调节RIPK1/FADD/Caspase-8 复合物（RDA中的关键复合物）的形成。通过免疫沉淀 FADD、O-GlcNAc糖基化抑制剂处理、OGT敲低、NF-κB 通路靶基因检测、免疫荧光等实验表明RIPK1在Ser331、Ser440和Ser669位点的O-GlcNAc糖基化可抑制RIPK1/FADD/Caspase-8 复合物形成，抑制细胞凋亡，从而介导肾细胞癌细胞中的舒尼替尼耐药。且RIPK1的O-GlcNAc糖基化在P65活化和核转位起到关键作用。

由于RIPK1的泛素化水平对于诱导细胞凋亡的 RIPK1/FADD/Caspase-8 复合物的形成至关重要。作者围绕O-GlcNAc糖基化是否可以调节RIPK1的泛素化这个问题进行了实验阐述。研究结果表明，舒尼替尼耐药的RCC 细胞中RIPK1的泛素化水平显着增加，OSMI-1处理或OGT敲低抑制O-GlcNAc糖基化可显着降低RIPK1的泛素化水平。进一步数据表明进是通过促进RIPK1和CYLD（一种去泛素化酶）之间的相互作用来调节RIPK1泛素化水平，同时减少RIPK1和cIAP2（E3连接酶）之间的相互作用。