项目文章Nat Metab (IF=18.9) | 华中科技大学和四川大学揭示生酮饮食重塑代谢的新机制

KD导致小鼠体重显著下降，显著提高了血液中的酮体 β-羟基丁酸（β-OHB）水平，降低了血糖水平，同时显著增加了Kbhb表达水平（图1a-d）。接下来将小鼠肝脏进行了多组学分析：转录组学、蛋白质组学、赖氨酸β-羟基丁酰化组学和代谢组学（图1e）。为了预测功能上重要的Kbhb位点，通过分层学习框架开发了pFunK模型，量化了Kbhb位点，预测到27种蛋白质中33个潜在的重要Kbhb位点。通过免疫印迹、免疫沉淀、荧光显微镜、伤口愈合试验、集落形成试验和肿瘤异种移植物等实验方法，研究了ALDOB-Kbhb在调节酶活性、mTOR信号通路和肿瘤增殖方面的作用。

通过肽的MS/MS光谱计数，发现3492（62.29%）个β-羟基丁酰化肽（图2a）。通过比较转录组、蛋白质组和赖氨酸β-羟基丁酰组数据，发现差异主要富集在脂质生物合成和转运过程（图2b-d），进一步代谢分析表明Kbhb修饰和能量代谢之间存在潜在的相关性（图2f-g）。通过26种双特异性酪氨酸磷酸化调控激酶检测结果，预测Kbhb修饰可能通过影响酶的催化活性和/或底物结合而发挥作用。

作者开发了一个分层学习框架，以预测功能性Kbhb位点（图3a）。pFunK与其他机器学习模型相比，准确性显著提高了（图3b-d）。pFunK还可以明确地区分功能性Kbhb位点和其他Kbhb位点（图3e）。并生成了混淆矩阵来可视化实际结果和预测结果之间的一致性（图3f-g）。pFunK在预测赖氨酸修饰位点、Kbhb位点和功能重要的Kbhb位点方面表现出卓越的性能。

pFunK筛选出27种蛋白质中的33个潜在功能性Kbhb位点，接下来，重点研究排名靠前的六个Kbhb（图4a-b）。在不同酶的Lys修饰位置引入了谷氨酰胺残基，其模拟了β-羟基丁酰化赖氨酸，除p.Lys97Gln突变体的酶活没有变化外，其他突变体的酶活性显著降低（图4c-g）。检查了六个位点的β-羟基丁酰化肽的MS/MS光谱，发现每个β-羟基丁酰化肽中至少可以明确识别出四对b离子和y离子（图4h-k）。因此证明pFunK是预测Kbhb位点的有力工具，可以通过Kbhb改变蛋白质的功能。

ALDOB可以催化果糖-1,6-二磷酸（FBP）转化为肝脏中的二羟丙酮磷酸盐和甘油醛3-磷酸（图5a）。KD可提高ALDOB上的Kbhbb表达水平，并且抑制ALDOB酶活性（图5b-c）。在细胞中，β-OHB也可以抑制ALDOB酶活性并增加ALDOB-Kbhb表达水平（图5d）。免疫沉淀也表明Na-β-OHB抑制ALDOB酶活性（图5e）。通过测量mTORC1下游靶点p-S6K和p-4EBP1的磷酸化水平（图5f），表明KD强烈抑制了mTOR通路。且ALDOB K108bhb能降低和FBP的结合，从而降低mTOR信号通路（图5g-i）。

通过肿瘤细胞增殖实验、划痕实验、裸鼠皮下成瘤实验、qPCR实验等证明ALDOB K108bhb抑制癌细胞mTOR信号通路和糖酵解过程，削弱癌细胞增殖（图6）。

ALDOB-Lys108bhb确实抑制mTOR信号通路，阻碍糖酵解并阻碍癌症增殖（图7a-c）。通过网络构建可以看出，ALDOB在mTOR信号通路、糖酵解和癌症增殖中的功能重要性（图7d）。pFunK模型计算的AUC值>0.9（图7e-f）。重组野生型HADH和突变体的酶活性也是类似的结果（图7g）。