项目文章Cancer Lett（IF 9.1）|北京中医药大学团队揭示中医诊疗中瘤周电针改善三阴性乳腺癌微血管正常化的分子机制

肿瘤血管生成是指肿瘤组织中已有的微血管床生成新血管的过程，是肿瘤的关键特征之一。近期研究表明，三阴性乳腺癌（Triple-negative Breast cancer, TNBC）比其它类型的乳腺癌具有更丰富的微血管系统。因此，抗血管生成治疗已成为TNBC靶向治疗的关键方案。针刺是中国传统非药物疗法的重要组成部分，近期研究表明针刺对乳腺癌和骨肉瘤的生长可能有一定的抑制作用。作者前期发现瘤周针刺可有效降低4T1乳腺癌局部微血管密度，且干预2h后移植瘤内紫杉醇浓度升高。因此，本文旨在研究瘤周针刺能否有助于肿瘤血管结构和功能正常化，以及内在的分子调控机制。

1.1 确认瘤周电针干预后第三天为最佳研究时间点

为选择瘤周电针治疗的最佳时间点，在电针治疗干预前（T0）到治疗后第7天（T7）使用微血管光声信号、肿瘤矢状面光声信号、图像定量分析ROI区域信号、血管指数、α-SMA表达水平，分析TG组、EATG组、BTG组模型肿瘤微血管随治疗时间的变化特征。发现T0时期，三组小鼠微血管光声信号均十分明显且各组间信号强度无显著差异。电针干预后，不同时间下TG组肿瘤区域微血管光声信号相对稳定且多呈分散簇状分布，其他两组呈现先降低后升高的趋势，在干预后第三天（T3）效果最佳，后续选择T3时间点开展研究（图1）。

1.2瘤周电针使4T1乳腺癌异种移植物的血管结构和功能正常化

T3时间点是瘤周电针治疗后效果最佳时间，此时瘤内血管结构和功能会出现哪些变化？进一步发现：

①血管结构方面：瘤周电针可显著降低4T1乳腺癌异种移植物微血管密度，增加周细胞覆盖率，且周细胞覆盖率比贝伐单抗（一种常用抗血管生成药物）效果更显著；

②血管基底膜完整性方面：电针可改善4T1乳腺癌异种移植物血管基底膜损伤，增强血管基底膜的完整性和稳定性、促进血管结构正常化；

③血管功能方面：瘤周电针可有效改善缺氧、改善肿瘤微血管渗漏、增强血液灌注，且对血液灌注的改善效果优于贝伐单抗治疗。

扫描电镜观察T3时间点4T1异种移植物的血管超微结构，发现相比于未治疗组，瘤周电针干预可使微血管趋向正常化，如：血管变圆、血管壁光滑、壁尖峰减少。透射电镜结果同样表明，瘤周电针干预可促进血管壁内皮连接更紧密，血管壁可见周细胞。该结果在免疫活性Balb/c小鼠的4T1肿瘤和免疫缺陷Balb/c小鼠的MDA-MB-231肿瘤模型中得到证实（图2）。

1.3瘤周电针可提高紫杉醇化疗疗效

随后，研究者在T1（EA1PTG）和T3（EA3PTG）时间点给予紫杉醇化疗，并比较两组肿瘤组织的生长效果，发现T3时间点给与紫杉醇化疗显著抑制肿瘤成长，而EA1PTG与单独紫杉醇化疗组（PTG）的肿瘤生长无显著差异（图3）。再次表明，在血管正常化时间窗内进行瘤周电针联合紫杉醇化疗具有重要意义。

为进一步揭示瘤周电刺对血管正常化治疗作用的分子机制，在T3时间点取TG和EATG组样本进行蛋白质组检测，通过差异分析发现，相比于TG组，EATG中有274种蛋白质差异表达（90个蛋白上调，184个蛋白下调表达）。KEGG富集分析表明，差异蛋白显著富集在丙酮酸代谢途径，该途径中EATG组GLO1和GLO2均显著下调。GLO1在解毒甲基乙二醛中具有关键作用（图4）。

对上述样本进行非靶代谢组检测以验证蛋白质组结果，差异分析结果表明，与TG相比，EATG组211种差异代谢物。检索差异代谢物种类发现，EATG组丙酮酸和甲基乙二醛相关通路中关键代谢物显著减少，而甲基乙二醛、I-谷胱甘肽和甘油3-磷酸含量增加。整合蛋白质组和代谢组数据发现，甲基乙二醛降解是EATG组显著改变的代谢途径。整体结果表明GLO1在调节瘤周电针治疗中具有关键潜在作用（图5）。

为验证组学分析得到的关键蛋白靶点GLO1及其相关甲基乙二醛代谢途径对微血管生成的调控功能。研究者使用GLO1药物抑制剂（BrBzGCp2）、HUVECs 细胞中GLO1敲低/过表达等实验验证并挖掘GLO1对微血管生成的调控功能。

① 内皮细胞中：CD31/GLO1荧光双染色发现，瘤周电针治疗可显著降低4T1乳腺癌异种移植组织内皮细胞中GLO1表达。流式细胞术分析表明，瘤周电针治疗后CD45-CD31⁺内皮细胞比例减少，内皮细胞群中GLO1的荧光强度降低。

② 血管生成方面：利用HUVECs转染细胞系进行小鼠Matrigel栓塞血管生成实验，发现：HUVECs中GLO1敲低可明显抑制野生型HUVECs血管生成，整体血管结构趋于更规则。还可显著减少栓塞内不同大小的血管密度和总长度、降低血红蛋白含量、显著减少内皮细胞的连接数、总长度和总分枝长度、降低微血管密度，募集周细胞和增加周细胞覆盖。GLO1过表达可使上述参数发生反向变化，而瘤周电针治疗可降低因GLO1过表达而引起的上述参数的异常表达。

③ 药物抑制和基因沉默实验：GLO1的下调表达可抑制HUVECs细胞增殖、下调HUVECs细胞迁移能力、降低HUVECs细胞发芽、促进HUVECs细胞凋亡。三维球体发芽试验表明，不同浓度的BrBzGCp2（GLO1药物抑制剂）处理后，球体发芽的数量显著减少。

甲基乙二醛是细胞糖酵解途径的副产物，而GLO1是参与甲基乙二醛解毒的限速酶。研究者发现，GLO1抑制剂BrBzGCp2在不同浓度下均能显著抑制HUVECs的糖酵解速率和最大糖酵解容量，且抑制程度与BrBzGCp2的添加量呈正相关。

丙酮酸、乳酸和谷胱甘肽是糖酵解途径的关键中间体。不同浓度的BrBzGCp2处理和HUVEGs中沉默GLO1均可导致乳酸和丙酮酸水平显著降低，增加细胞内GSH水平。相反GLO1过表达可增加细胞外乳酸和丙酮酸，降低细胞内GSH水平。

氧化磷酸化和糖酵解是内皮细胞产生ATP的主要途径。BrBzGCp2处理（10um和15um）与HUVEC中GLO1沉默均可导致总ATP生成速率降低。而GLO1过表达导致总ATP生成速率增加。

随后，研究者分析HUVECs中GLO1药物抑制或敲低对糖酵解-甲基乙二醛途径的中的关键蛋白和相关血管生成因子的调控，发现GLO1的下调可显著增加甲基乙二醛(MGO)的表达，下调血管生成因子：VEGFA、VEGFR2、ANG和PDGFB的表达。而GLO1过表达出现与上述结果相反的现象。

最后，为充分验证GLO1下调对整体脉管系统的抑制作用，研究者使用特异性探针构建斑马鱼GLO1敲低模型并使用qRT-PCR证实模型成功建立。结果表明，GLO1敲低组血管生长发育明显受到抑制，斑马鱼体间血管（ISV）管腔明显变窄，并伴有尾静脉丛（CVP）数量减少。北侧纵向吻合血管（DLAV）和淋巴系统的前体淋巴管母细胞（PAV）的发育也因GLO1敲低而受阻。同时，GLO1敲低显著影响斑马鱼心血管发育，使其出现心包水肿，心跳异常，心包面积明显增加。

整体研究表明：瘤周电针通过抑制内皮细胞中的乙二醛酶e1（GLO1）来减轻三阴性乳腺癌的糖酵解和血管生成，从而促进三阴性乳腺癌移植瘤血管正常化。

[1] Wan YX, Qi XW, Lian YY, et al. Electroacupuncture facilitates vascular normalization by inhibiting Glyoxalase1 in endothelial cells to attenuate glycolysis and angiogenesis in triple-negative breast cancer. Cancer Lett. 2024 Jun 29;598:217094.