Nat Methods | 探索空间基因表达的多元选择： 11种基于测序的空间转录组学方法的系统比较！

10x Genomics Visium（基于poly-A和基于探针的两种方法）、DynaSpatial、HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq V2、Curio Seeker（Slide-seq的商业版本）、Slide-tag、Stereo-seq、PIXEL-seq、Salus和DBiT-seq的11种空间转录组技术（sST）。

小鼠胚胎眼、小鼠大脑海马区和小鼠嗅球；

从成年小鼠大脑和E12.5小鼠胚胎中获得海马和眼组织，根据组织模式手动划定边界，对同一区域分析不同平台的数据，发现不同空间转录组测序平台读数数量远未达到饱和，表明sST数据需要更多的测序数据量以实现最佳性能；Stereo-seq在小鼠海马和眼睛的同一区域具有更多的测序读数，捕获组织的面积也是最大的；Visium(探针)在小鼠眼中的总计数最高，可能是由于基于探针的方法具有更好的读取捕获效率，及使用探针时过度量化的唯一分子标识符(UMI)计数的潜在影响。控制测序深度，Slide-seq V2数据在小鼠眼中的灵敏度最高，而在海马中，基于探针的Visium,、DynaSpatial灵敏度更高。在小鼠嗅球的研究中，PIXEL-seq具有最高的灵敏度，而HDST在10 μm物理分辨率下灵敏度最低。

除单位面积分子捕获外，另一个重要的质量参数是mRNA检测的空间准确性。采用两种分析方法来测量分子横向扩散:(1)绘制特定基因在所选区域的强度分布图;(2)量化所选区域内强度左半最大宽度(LWHM)之间的距离，重点关注所选基因表达应表现出显著差异的组织学结构，在该区域的一部分表现为高表达，其余部分表现为极少或无表达。嗅球选择Slc17a7（特定组织层的特异性表达基因）作为标记基因，Slide-seq V1.5和PIXEL-seq对这种扩散的控制相对较好。Visium(polyA)更清楚地保留了嗅球中Slc17a7跨层表达的两个峰，而DynaSpatial几乎没有提供分离的表达峰。大脑选择Ptgds（特定位置的血管细胞中特异性表达基因）作为标记基因，Slide-seq V2较好控制横向扩散问题。眼部组织选择Pmel（在围绕晶状体并形成圆形图案的黑素细胞中特异性表达）作为标记基因，Stereo-seq对横向扩散的控制效果最好。三个组织的发现形成对比，表明组织类型对扩散过程有相当大的影响，此外透化时间对扩散模式和mRNA捕获也有很大影响。

对选定的sST方法深入了解生物学问题，本研究选择E12.5小鼠的眼睛复杂结构，为了识别出更详细且一致的细胞亚群，分别利用Seurat、DR.SC和PRECAST等软件的聚类方法，对各sST平台捕获的数据进行注释，发现Stereo-seq和Slide-seq V2在全面亚群注释方面表现突出，能够成功捕获所有预期的细胞亚群。BMKMANU S1000数据在细胞状态检测方面面临挑战，特别是在识别黑素细胞方面。这种困难可能源于BMKMANU S1000数据中观察到的明显的横向扩散，Visium和DynaSpatial在检测预期的细胞亚群时受到一定的分辨率限制。

在组织血液污染方面，与snRNA-seq相比，Stereo-seq显示出相似的血液污染水平，Slide-seq V2具有最低的血液污染水平，而BMKMANU S1000的70%位点表达Hba-a1。

该研究进一步分析数据，使用Wilcoxon秩和检验在Seurat中识别不同聚类间的标记基因，发现不同平台在标记基因选择上存在特异性偏差。例如，stereo-seq在识别Pax6等关键基因展现了技术特异性偏差下的独特准确性。深入比较下采样数据与全数据中的标记基因，发现随着测序深度增加，标记基因数量增加，Slide-seq V2显示出更高的灵敏度。各平台有更多独特的标记基因。细胞间通讯分析未发现一致结果。

本研究是全球首个且是规模最大的空间组学技术的系统比较，建立了完整的评估方案，包括标准品的建立、实验流程、数据分析流程、具体指标等等，而且全部公开可重复。通过评估，一些国产的技术平台的指标已经达到领先，凸显了中国在这一新兴领域的快速发展趋势。市面不断推出一些新产品，如Visium HD空间转录组，该比较研究将在网站上https://genographix.com/home持续更新。