Nat Commun | 帕金森病症状出现前7年即可预测！血浆蛋白实现神经退行性疾病标志物研究新突破
2024-07-08
中科新生命
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帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种复杂且日益普遍的中枢神经系统（CNS）神经退行性疾病。快动眼睡眠行为障碍（RBD）是最具代表性的PD伴随症状之一，当患者仅存在RBD症状，而不伴随其他神经系统相关疾病时称为特发性RBD（iRBD）。长期队列研究表明，高达80%的iRBD患者会发展为PD及PD综合征等疾病，使RBD成为PD最强预测因子之一，因而RBD的早期诊断非常重要。
2024年6月18日，Nat Commun（IF=14.7）发表题为“Plasma proteomics identify biomarkers predicting Parkinson's disease up to 7 years before symptom onset”的文章，利用血浆蛋白质组学检测鉴定出8种蛋白标志物， 能够以100%的特异性区分PD和健康对照（HC），并识别79%的孤立性快速眼动睡眠行为障碍（iRBD）患者。这8种血液蛋白panel可指示早期阶段的分子事件，并有助于识别旨在减缓/预防运动帕金森病的临床试验的高危参与者。
实验材料
血液样本；
技术方法
定量蛋白质组学Label free，靶向蛋白质组学MRM；
实验分组
运动帕金森病患者（n=99）、孤立性快速眼动睡眠行为障碍（iRBD）的运动前个体（n=18）和健康对照（n=36），其他神经疾病患者（n=41）；
实验路线
工作流程如图1所示，该研究包括三个阶段：
第0阶段：通过非靶向质谱法以识别候选的潜在生物标志物；
第1阶段：发现阶段的候选蛋白通过靶向质谱MRM方法并应用于更大的独立队列；
第2阶段：改进靶向MRM方法并评估靶向蛋白质组合的临床可行性；
图1 研究的整个工作流程
研究结果
1. 蛋白质组学发现标志物（第0阶段）
发现队列纳入10名初治PD患者和10名HC对照，收集血浆样本采用Label free蛋白质组学鉴定出895种蛋白质，其中47种在从PD组和对照组之间差异表达，GO通路分析表明炎症通路显著富集（图2）。
图2 发现阶段：PD和健康对照血浆样本的蛋白质组学分析
2. 选择用于靶向蛋白质组学验证的蛋白质
作者创建了一个有针对性的蛋白质组学panel，包括前面发现阶段的蛋白，以及一些其他的文献报道的蛋白标志物，这些蛋白包括一些已在先前的PD，阿尔茨海默病（AD）和衰老相关的蛋白，还纳入了文献中发现的几种已知的促炎和抗炎蛋白，此前已开发为内部靶向蛋白质组神经炎症组合。这种靶向蛋白质组学验证panel包括121种蛋白质。
3. 靶向蛋白质组学验证阶段（第1阶段）
作者使用独立队列，包括新发PD（99例）、健康对照者（36例），这是主要队列，作者还纳入iRBD患者（18例）以及其他神经系统疾病（OND）患者（41例），取血浆样本开展靶向蛋白质组学分析（表1）。
表1 靶向蛋白质组学纳入样本情况（第1阶段）
4. 鉴定PD和HC之间差异表达的蛋白—靶向蛋白质组学验证阶段（第1阶段）
对121种蛋白开展靶向蛋白质组学验证，检测到32种蛋白，其中有23个被证实在PD和HC之间显著差异表达。在iRBD患者和HC以及OND和HC之间鉴定了6种差异表达的蛋白质，如图3所示。
图3 PD、HC以及OND和iRBD的验证队列的工作流程和靶向蛋白质组学分析结果
疾病与正常组之间显著不同的蛋白质以Box-scatter 图的形式展示，如图4所示。
图4 对照组和不同疾病组（PD、iRBD、OND）之间显著差异表达蛋白
5. 差异表达蛋白的生物学意义—靶向蛋白质组学验证阶段（第1阶段）
作者使用通路分析（Ingenuity Pathway Analysis，IPA）评估差异表达蛋白质的参与的生物过程，主要分析PD和HC之间显著差异表达的蛋白，确定了三个主要通路簇，包括 （i）丝氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶以及补体和凝血成分的表达，（ii）内质网（ER）应激/热休克相关蛋白，（iii）VCAM1、SELE和 PPP3CB 的表达。最高的富集分数的通路包括：急性期反应信号通路、凝血系统、补体系统、LXR/RXR 激活、FXR/RXR 激活和糖皮质激素受体信号传导，这些都是参与炎症反应的通路。根据本研究中观察到的蛋白质表达，暗示发生PD的发病机制：神经元路易体包涵体中α-突触核蛋白的寡聚化和积累，并最终导致多巴胺能神经元细胞丢失（图5）。
图5 IPA分析提示差异表达蛋白参与神经元突触核蛋白疾病
6. 使用蛋白质Panel预测PD—靶向蛋白质组学验证阶段（第1阶段）
作者应用机器学习，使用验证阶段的 PD 和 HC 样本构建判别OPLS-DA模型。对类分离影响最大的蛋白质是GRN、DKK3、C3、SERPINA3、HPX、SERPINF2、CAPN2、SERPING1和SELE。随后，作者利用上述蛋白构建了能够预测个体是属于PD组还是HC组的回归模型，进而确定了一组以100%准确率区分PD和HC的蛋白质，该8个预测因子的模型：GRN、MASP2、HSPA5、PTGDS、ICAM1、C3、DKK3和SERPING1，在ROC和PR曲线上均实现了1.0的AUC（图6）。在作者的模型中，被归类为PD的iRBD样本比例（OPLS-DA模型为72%，SVM模型为94%）与基于纵向队列研究的临床证据一致，报告称超过80%的iRBD受试者会发展为伴有运动障碍和/或认知能力下降的晚期。
图6 线性支持向量分类PD和HC
7. 优化MRM方法并评估独立纵向iRBD队列—靶向蛋白质组学独立队列（第2阶段）
为了评估针对高危受试者的初始预测模型的结果，作者开发并改进了靶向蛋白质组学检测panel，仅定量那些从初始靶向蛋白质组学测定中易于可靠检测到的蛋白质（n=32）。接着作者纳入来自54名iRBD患者的146个纵向样本的独立队列，应用于第一阶段构建的两个机器学习模型（OPLS-DA 和支持向量机）（PD与HC）。OPLS-DA 模型基于所有 32 种检测到的蛋白质，将70%的iRBD样品鉴定为PD，而基于8种蛋白质的SVM模型将79%的样品鉴定为PD。纵向iRBD验证队列中的54名受试者中有16名患有PD/DLB。最早的正确分类是表型转化前7.3年，最晚的分类是诊断前0.9年（图7）。
图7 iRBD独立纵向样本的预测结果
8. 差异蛋白生物标志物与靶向蛋白质组学验证阶段（I期）患者临床数据之间的相关性
作者评估了PD和HC中的蛋白质表达与临床评分（MMSE，H&Y和UPDR）的相关性。中枢补体级联蛋白C3与MMSE呈负相关，与H&Y、UPDRS III和Total score呈正相关。UPR调节蛋白BiP（HSPA5）与MMSE呈负相关，与H&Y和UPDRS II、III和Total score呈正相关。一般来说，MMSE评分与H&Y阶段和UPDRS评分呈负相关（图8）。
图8 差异表达蛋白与患者临床数据之间的相关性
表2 PD和HC通过MRM验证的蛋白与临床PD评分的Spearman相关性的p值
总结
该研究通过非靶向蛋白质组学找到了PD与HC之间的差异蛋白，利用这些差异蛋白和通过文献精心挑选的生物标志物共同组成了一个包含213种蛋白的候选蛋白标志物库，并开展靶向蛋白质组学验证，与最先进的机器学习生物信息学结合，得到了一组8种生物标志物来区分早期PD和HC。该生物标志物组合提供了PD发病机制的独特特征，如触发氧化应激和神经炎症，导致α-突触核蛋白聚集和 LB 形成。此外，在运动/认知症状发展的前7年，该特征已经存在。最重要的是，该血液panel可以在未来进一步验证后帮助识别有患PD/DLB风险的受试者，并为即将开展的预防试验对他们进行分层。
参考文献
Hällqvist J, Bartl M, Dakna M, Schade S, Garagnani P, Bacalini MG, Pirazzini C, Bhatia K, Schreglmann S, Xylaki M, Weber S, Ernst M, Muntean ML, Sixel-Döring F, Franceschi C, Doykov I, Śpiewak J, Vinette H, Trenkwalder C, Heywood WE, Mills K, Mollenhauer B. Plasma proteomics identify biomarkers predicting Parkinson's disease up to 7 years before symptom onset. Nat Commun. 2024 Jun 18;15(1):4759. doi: 10.1038/s41467-024-48961-3. PMID: 38890280; PMCID: PMC11189460.
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