营养不良，如何补充营养？一套肠道菌群+血液蛋白多组学数据，3篇文章给你答案！

根据营养不良程度，可将儿童营养不良分为：急性营养不良，中度急性营养不良（MAM）、非水肿性严重急性营养不良（SAM）。儿童营养治疗的研究虽然降低了其死亡率，但对其后遗症治疗以及肠道微生物群恢复的研究较少。本研究通过先导试验，发现MDCF-2，RUSF两种食疗可改善儿童的生长指标。因此，接下来探索两种治疗方案下，儿童肠道菌群、血浆蛋白、生长指标的差异性，以及治疗完成后的2年内儿童肠道菌群和血浆蛋白的持续性变化。

入组队列：

124名患有中度急性营养不良（MAM）的孟加拉国儿童（12-18个月）为其3个月的MDCF-2（n=61）或RUSF（n=62）的饮食治疗试验，随访两年。

样本收集：

（1）在治疗前收集粪便和血浆样本作为基线数据。在治疗过程中，治疗第一个月每周1次，第二个月和第三个月每4周一次，停止治疗后在随访的第一、六、十二个月，每月一次收集粪便样本。共928个样本。

（1）临床数据表明，接受MDCF-2治疗的儿童在WLZ（weight-for-length Z score）、WAZ（weight-for-age Z score）指数上优于RUSF组；

为评估MDCF-2、RUSF饮食在治疗前、治疗中、治疗后对儿童生理指标的影响。在治疗后3个月的随访中，对两组儿童的体重、身高、臀围等指标进行测定，发现MDCF-2组儿童的WLZ指数，WAZ指数均优于RUSF组，表明MDCF-2组的儿童生长速度比RUSF组更快。使用线性混合效应模型同样发现，治疗过程中，MDCF-2组儿童的WLZ指数显著优于RUSF组，并且该优势在治疗后一段时间内仍得以保持。LAZ指数（length-for-age Z score）在治疗过程中不存在显著差异，而在治疗后的随访过程中MDCF-2组显著高于RUSF组（图2）。

（2）蛋白质组结果表明，骨骼生长、神经发育、炎症相关蛋白可区分MDCF-2与RUSF的治疗效果;

血液容纳了来自患病细胞和周围组织释放的各类分泌蛋白，是衡量个体表型和健康状况的直接指标。本研究通过SomaScan检测到4977种蛋白质种类和丰度。为量化“治疗时间-LAZ指数-治疗前后蛋白质变化”间的关联，对每个儿童构建线性混合效应模型，算法如下（图3）：

①构建WLZ指数（or LAZ指数）随时间变化指数β-WLZ（β-LAZ）（图3A）；

②计算治疗期间蛋白质丰度差值，Δprotein abundance（图3B）；

③构建β-WLZ与Δprotein abundance的线性回归模型，计算两者间的相关性（图3C）。

通过该算法，共筛选出75种蛋白质与β-WLZ。GSEA结果表明该类蛋白质主要参与到骨生长和骨化介质、软骨寡聚基质蛋白、分泌卷曲相关蛋白途径（图4）。

为进一步剖析治疗方式对蛋白质丰度的影响，利用MDCF-2、RUCF治疗3个月后的样本进行差异分析，发现MDCF-2处理导致714种蛋白质出现显著差异，RUSF处理导致82种蛋白质显著差异表达。其中在MDCF-2组中增加更多而在RUSF组中无变化的蛋白质主要为：软骨中间层蛋白2、血小板反应蛋白-4、破骨细胞抑制剂SFRP4。同时，MDCF-2组中，β-WLZ变化较大的儿童在开始时更加消瘦，骨生长和神经发育水平较低，促炎蛋白水平较高。到MDCF-2治疗结束时，上四分位数的儿童在骨生长和CNS发育方面增加最多，炎症反应物方面减少最多（图4）。总体结果表明，MDCF-2与RUSF治疗对血浆蛋白质的差异主要体现在骨骼生长、神经发育、炎症等相关途径中。

治疗期间与β-WLZ显著相关的蛋白质在治疗后的一段时间内是否持续保持这种相关性？在加入年龄和性别因素后，将75种蛋白质中的每种蛋白质变化率线性回归到24个月随访期中WLZ或LAZ的变化率，发现有37种蛋白质与LAZ变化率显著正相关，主要为肌肉骨骼发育的生物标志物或者胰岛素样生长因子-1（IGF-1），该蛋白质可与生长激素协同作用，调控儿童线性生长（消瘦和发育迟缓）。在治疗期间，37种蛋白质在两组治疗中无差异，但在随访6个月时，37种蛋白在MDCF-2组中的水平明显高于RUSF组，在随访12个月后这种差异不在显著。整体结果表明，对12-18个月大的孟加拉国MAM儿童进行3个月的MDCF-2治疗后，可改善儿童的体重和身高生长，并且生长和中枢神经系统发育生物标志物在治疗结束后6个月内明显升高（图5）。

（3）宏基因组结果表明Prevotella.copri 是MDCF-2治疗影响的关建菌群

为分析治疗后随访期间MDCF-2和RUSF处理的参与者的粪便微生物群落，使用宏基因组对治疗后6个月和12个月儿童的粪便样本进行检测，共获得1000个高质量MAGs，并将该数据与治疗过程中以及治疗后1个月的粪便数据进行整合，最终从928个样本中获得了851个高质量MAGs。使用同蛋白质组一样的方法，获得75个与WLZ正相关，147个与WLZ负相关的MAGs（图6）。其中与WLZ正相关的MAGs也与LAZ存在相关性。

PCA分析表随访1和6个月以及6和12个月MDCF-2和RUSF样本出现明显分离，这种分离在儿童成长到16至33个月时消失。由于通过差异分析，并未在治疗阶段、治疗结束、治疗后随访12个月的时间段内发现显著差异表达的MAGs，作者随即转换策略，对上述获得的75个与WLZ正相关，147个与WLZ负相关的MAGs进行GSEA分析，将融合了性别、取样时年龄、治疗方式等指数作为MAGs丰度作为排序值。发现在治疗结束和治疗后随访1个月的时间，与WLZ呈正相关的15个MAGs在MDCF-2治疗组中富集，而与WLZ呈负相关的MAGs在RUSF组中富集。其中Prevotella.copri MAGs的Bg0018和Bg0019与WLZ呈正相关，参与MDCF-2中富集的聚糖代谢的多糖利用位点。治疗后随访6个月时，MAGs在两种治疗组中的富集差异消失（图7）。

文章最后，根据在随访期间LAZ随时间关系的系数对MAGs进行排名开展GSEA分析，发现一组与LAZ呈正相关的4个物种：Agathobacter faecis、Blautia massiliensis、Lachnospira sp000436475、Dialister sp000434475。其中Agathobacter faecis通过单糖和寡糖发酵产生有益的短链脂肪酸（SCFA）丁酸盐；Blautia massiliensis具有丰富的碳水化合物运输和代谢能力，其发酵关键产物为醋酸；Lachnospira sp000436475和Dialister sp000434475有助于碳水化合物的发酵和短链脂肪酸的产生。对丰度与LAZ呈正相关的MAGs进行GSEA分析，发现并未富集到代谢相关途径中，猜测本研究测到的宏基因组只能反应肠道菌群的DNA丰度，该信息不能精确描述肠道菌的功能活性，后期可补充宏转录组再进一步分析。

（1）队列选择及随访时间

发育迟缓是儿童营养不良的表现形式之一，发育迟缓通常始于产前，并与母亲的身高、年龄等因素有关。出生后，在环境压力因素下（如不良饮食、感染、收入），发育迟缓可能会继续恶化，直到至少2岁。因此，本研究饮食治疗3个月后，随访了2年时间，观察治疗结果的延续性。

 （2）组学选择

临床标志物筛选研究中，具有超高灵敏度的组学检测技术对推动临床大队列研究具有重要的数据支撑作用。本研究中使用的SomaScan技术直接从血浆中定量到4977种蛋白质，对于血浆、血清这类富含高丰度蛋白质的样本，在未去除高丰度蛋白质的情况下能鉴定到这个数据实属优秀。目前，中科新生命的SomaScan再次升级，分别靶向检测7000个（p7k）和11000个蛋白质（p11k），实现更高深度的蛋白质检测。如上个月，国内发表的第一篇SomaScan文章中，作者利用该技术在血浆中鉴定到6557个蛋白质，远高于质谱得到的723个蛋白质。其中有463种蛋白质同时被SomaScan与质谱检测到^[4]。

（3）个性化的分析策略

大队列研究伴随极大数据量，为更有效挖掘目标数据，常规的差异分析、功能富集等方法往往难以满足高数据集的分析需求。文章中，作者独辟蹊径，构建“治疗-生长指数-菌群（or蛋白质）”，挖掘到与身体生长指数以及治疗周期均显著相关的feature。同时，在PCA结果指示治疗后1和6个月，6和12个月的粪便样本存在显著分离，而差异分析未找到显著差异的MAGs时，立即换种打法，利用GSEA分析挖掘关键MAGs，得出在治疗中和治疗后随访的1个月时，MAGs在两组中的富集程度有差异，当随访6个月时，差异消失，与PCA分析结果一致。小编不禁竖起大拇指，赞叹作者的数据处理灵活性，有道是“分析策略千万条，挖掘目标数据第一条”！

（4）一套数据，多篇文章，性价比拉到最高

临床队列样本的前期资金投入往往达到几十万甚至上百万。通过重复利用数据、更换算法、补充新组学，可收获更深入，多顶刊的研究成果。本研究同时结合宏转录组、代谢组，不仅发现MDCF-2与RUSF配方中碳水化合物组成，同时挖掘到Prevotella.copri菌株在代谢MDCF-2治疗中发挥关键作用，该结果同步发表在《medRxiv》、《Science》中。