Cell (IF 64.5) | 精氨酸通过RBM39重新编程肝癌中的代谢

临床肝癌组织和癌旁组织

肝脏特异性Tsc1和Pten双重敲除小鼠（L-dKO小鼠）

多种肝癌细胞（具体见文章）

对mTOR驱动的HCC小鼠模型中分离的肝肿瘤进行了非靶向代谢组学分析，层次聚类热图显示916个代谢物在L-dKO肿瘤中丰度显著改变（图1A），代谢途径富集分析表明，精氨酸代谢在L-dKO肿瘤中发生了强烈改变（图1B）。氨基酸靶标检测表明，精氨酸水平在L-dKO肿瘤中升高，而其他氨基酸的含量不变或降低（图1C）。免疫印迹证实肿瘤组织中精氨酸合成酶（CPS1、OTC、ASS1 和 ASL）表达下调，精氨酸转运蛋白（SLC7A1、SLC7A6 和 SLC7A7）表达上调，显示精氨酸代谢普遍失调（图1E）。同位素标记精氨酸显示，肿瘤组织中精氨酸含量较高，并且通过精氨酸饮食也发现精氨酸摄入越多，肝脏中肿瘤负荷增多并且肝脏中精氨酸含量也高（图1E-H），说明肿瘤增加精氨酸摄取以补偿精氨酸合成的下调。

细胞生长所必需的多胺主要的种类是腐胺、亚精胺和精胺，多胺在各种癌症中含量较高，精氨酸是多胺的前体，将精氨酸转化为多胺需要消耗大量精氨酸。本研究中小鼠肿瘤中多胺代谢酶的表达也发生了改变，精氨酸酶1 (ARG1)和胍丁胺酶 (AGMAT)通过两条平行途径催化精氨酸到多胺的转化，二者在肿瘤中表达下调，其他多胺代谢酶的蛋白水平没有变化（图2A-D）。给肿瘤小鼠和对照小鼠注射了表达ARG1 (AAV-ARG1)或AGMAT (AAV-AGMAT)的肝细胞特异性腺相关病毒(AAV)，注射AAV-ARG1或AAV-AGMAT的肝脏肿瘤负荷减少，注射AAV-ARG1或AAV-AGMAT降低了非肿瘤组织中的精氨酸水平，但在少数逃逸性肿瘤中没有，再次表明高精氨酸水平与致瘤性之间存在很强的相关性（图2E-G），表明ARG1和AGMAT被抑制以减少精氨酸的消耗，从而维持肿瘤发生所需的高水平未代谢的精氨酸。

使用慢病毒系统在SNU-449细胞系中稳定表达ARG1、AGMAT或ARG1和AGMAT(ARG1/AGMAT)，ARG1或AGMAT的表达显著降低SNU-449细胞的克隆生长，ARG1/ AGMAT的共表达也抑制了细胞的生长，同时精氨酸也降低了（图3A-D）。通过转录测序结果表明，低精氨酸条件下，ARG1和AGMAT的过表达改变了肝癌细胞的基因表达模式，包括氨基酸、糖类、脂肪酸等多种代谢途径的关键酶的表达发生改变（图3E-G），天冬酰胺合成酶(ASNS)、丝氨酸合成通路的关键酶(PSAT1)、磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)蛋白水平降低，而烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）蛋白水平升高（图3H）。而过量精氨酸的加入逆转了ARG1/AGMT对特征基因表达的影响，ASNS、PSAT1和PSPH蛋白水平升高，而NNMT蛋白水平降低（图3I）。总之，精氨酸在转录水平上控制致癌代谢。

与对照细胞相比，ASNS是ARG1/ AGMAT表达细胞中差异最大的基因，天冬酰胺（ASN）可以促进必需氨基酸的吸收，同时介导精氨酸摄取的单转运蛋白和反转运蛋白上调。在ASNS被抑制的过表达ARG1/ AGMAT的SNU-449细胞中精氨酸摄取减少，细胞培时加入ASN可以恢复细胞对精氨酸的摄取（图4A-B）。ASNS的稳定表达增加ARG1/AGMAT表达细胞精氨酸的摄取，促进克隆生长，也恢复了特征基因的表达（图4C-F）。使用肝细胞特异性AAV敲除L-dKO小鼠来评估ASNS高表达对体内肿瘤发生的重要性，ASNS敲除后，非肿瘤组织中的精氨酸水平降低，而肿瘤组织中的精氨酸水平升高，L-dKO小鼠的肿瘤负荷减轻（图4G-I）。总之，ARG1和AGMAT的缺失增强了精氨酸的积累，导致ASNS依赖精氨酸的表达。ASNS衍生的天冬酰胺进一步增强精氨酸的摄取。

用精氨酸偶联小珠进行了下拉实验鉴定潜在的精氨酸结合蛋白，在L-dKO肿瘤和SNU-449裂解物的下拉蛋白中分别显著富集349种和461种蛋白（图5A）。RBM39是一种必需的富含精氨酸-丝氨酸的RNA结合蛋白，参与mRNA前体剪接和转录共激活或共抑制。RBM39可以用精氨酸偶联珠从L-dKO肿瘤和SNU-449细胞中纯化出来（图5B）。从哺乳动物细胞或细菌中免疫纯化的重组RBM39结合放射标记的精氨酸，这种方式可以有效地与过量的“冷”L-精氨酸竞争，而不能与赖氨酸或D-精氨酸结合。因此，精氨酸特异性结合RBM39（图5C-D）。在大肠杆菌中表达了重组RBM39片段以鉴定RBM39的精氨酸结合区是RBM39(1-244)（图5F-G）。表明精氨酸特异性结合RBM39的N端区域促进了ASNS的表达。

用抗癌药物（Indisulam）处理SNU-449细胞降低了RBM39蛋白水平，同时也降低了ASNS、PSAT1、PSPH和GLSK表达水平，增加了GLUT3、HK2、NNMT和AOC3表达水平（图6A-B）。改变了葡萄糖、丙酮酸、氨基酸、NAD+代谢相关基因表达（图6C）。因此，精氨酸通过RBM39控制代谢基因表达。在SNU-449细胞中表达RBM39野生型和突变型。如重组flag标记的全长RBM39；RBM39缺乏N端精氨酸结合区(称为RBM39ΔN)。重组G268V突变RBM39产生Indisulam抗性。在RBM39ΔN和RBM39ΔN- NLScMYC SNU-449细胞中，ASNS的表达减少，但在表达全长RBM39的细胞中ASNS的表达没有减少（图6E-F）。此外，RBM39精氨酸结合缺陷突变体使ASNS和PSAT1启动子活性降低（图6G）。RBM39需要其精氨酸结合域来控制代谢基因的表达。表达精氨酸结合缺陷RBM39的SNU-449细胞中，Indisulam的存在降低了克隆生长。N末端的缺失可以影响RBM39的功能，从而影响克隆生长，而不依赖于精氨酸的结合(图6H)。RBM39在L-dKO肿瘤中的表达升高，RBM39敲低降低了L-dKO小鼠的肿瘤负荷，RBM39的敲低与非肿瘤组织中ASNS mRNA和精氨酸水平的降低相关。Indisulam治疗降低了L-dKO肿瘤中RBM39蛋白水平，也逆转了精氨酸诱导的RBM39对ASNS和其他代谢酶表达的影响（图6I-O）。总之，精氨酸结合的RBM39通过转录重编程代谢从而促进致瘤性。

WB证实，与邻近的非肿瘤组织相比，癌症患者肿瘤中ARG1和AGMAT减少，RBM39和ASNS水平升高（图7B）。对100多个HCC样本的组织微阵列分析证实了HCC中ARG1和AGMAT的显著缺失（图7C-D），此外，基于TCGA癌症数据集，ARG1和/或AGMAT的缺失与生存率降低相关（图7E）。11对配对肿瘤和非肿瘤患者活检的非靶向代谢组学显示，尿素循环代谢产物鸟氨酸和瓜氨酸减少，而精氨酸和乙酰化多胺增加（图7F）。RBM39被证实为精氨酸结合蛋白（图7G）。20组类器官都以剂量依赖性的方式被药物遏制生长（图7H）。

代谢小课堂——“氨”家把关癌症治疗