Ribo-seq：翻译组测序

Ribo-seq（Ribosome profiling或Ribosome sequencing）是一种新兴的转录组学技术，它通过深度测序被核糖体保护的mRNA片段（RPFs）来研究基因表达的转录层面和翻译层面的动态变化。本文将介绍Ribo-seq的基本原理、应用领域、技术流程、分析内容和样本要求。

 

 

一、Ribo-seq简介

 

Ribo-seq（核糖体印记测序），作为一种翻译组测序技术，已被广泛应用于研究细胞内mRNA的翻译动态。通过测序与核糖体结合的mRNA片段（RPFs），该技术能够揭示在特定条件下哪些mRNA正在被翻译，以及它们的翻译效率和起始位点等关键信息。Ribo-seq的应用极大地促进了对基因表达转录后调控、疾病机制和药物作用机理的理解。

 

 

二、Ribo-seq应用领域

 

1.研究转录与翻译的耦合：通过比较Ribo-seq和RNA-seq数据，可以研究转录和翻译过程的耦合关系，揭示基因表达调控的复杂性。

 

2.发现非编码RNA的翻译潜力：Ribo-seq能够鉴定出传统方法无法发现的非编码RNA（如lncRNA）上的翻译活动，揭示这些RNA的潜在功能。

 

3.探索翻译调控的新机制：通过分析翻译效率的变化和翻译起始位点的选择，Ribo-seq可以帮助发现影响翻译过程的新因素和新机制。

 

4.研究蛋白质合成与细胞应激的关系：在细胞应激（如氧化应激、热休克）条件下，Ribo-seq可以用于研究蛋白质合成的变化和应激响应机制。

 

5.研究病毒感染对宿主翻译的影响：在病毒感染的研究中，Ribo-seq可以揭示病毒如何影响宿主细胞的翻译过程，以及宿主如何通过翻译调控机制应对病毒感染。

 

 

三、Ribo-seq分析内容

 

1.翻译起始位点的精细定位：

 

(1) 确定mRNA上的翻译起始位点（TSS）的精确位置。

(2) 识别非传统的翻译起始位点，如非AUG起始密码子。

 

2.翻译效率分析：

 

(1) 计算不同mRNA或不同条件下的翻译效率。

(2) 分析翻译效率的变化及其与转录水平的关系。

 

3.编码潜在蛋白质的鉴定：

 

(1) 发现新的翻译开放阅读框（ORFs）和潜在的蛋白质编码区域。

(2) 鉴定翻译产物的多样性，如翻译异构体和翻译后修饰。

 

4.翻译调控机制的探索：

 

(1) 研究翻译起始因子和其他翻译调控因子的作用。

(2) 分析翻译过程中的暂停、终止和再启动事件。

 

5.翻译暂停位点的识别：

 

(1) 通过分析核糖体在mRNA上的分布，识别翻译过程中的暂停位点。

(2) 探索翻译暂停的生物学意义和调控机制。

 

6.翻译终止效率的分析：

 

(1) 研究翻译终止的效率和终止密码子的识别。

(2) 分析影响翻译终止的因素，如终止因子和RNA结构。

 

7.翻译框架转移的检测：

 

(1) 检测翻译框架转移（frameshifting）事件及其调控机制。

(2) 分析框架转移对蛋白质功能和表达的影响。

 

8.翻译异构体的研究：

 

(1) 研究不同翻译起始位点产生的蛋白质异构体。

(2) 分析异构体在细胞功能和疾病中的作用。

 

 

四、Ribo-seq样本要求

 

样本要求	说明
样本质量	需要高质量的细胞或组织样本，RNA完整性和纯度需满足实验要求。
样本量	根据实验设计和测序深度的要求，确定所需的细胞数量或RNA量。
处理条件	细胞裂解和核糖体保护片段制备的条件（如裂解缓冲液、核酸酶处理时间）需要严格控制。
RNA提取	提取的RNA需经过特定处理，以保留与核糖体结合的mRNA片段。
文库构建	构建适合Ribo-seq的文库，需要特定的试剂和方法。
数据质量	测序数据的质量需满足后续分析的要求，如测序深度和覆盖度。

 

 

五、Ribo-seq实验流程

 

步骤	描述
1. 细胞裂解	将细胞裂解以释放核糖体和mRNA，通常使用裂解缓冲液。
2. 核糖体保护片段（RPFs）制备	用核酸酶消化未被核糖体保护的mRNA，然后提取与核糖体结合的mRNA片段。
3. RPFs处理和测序文库构建	将RPFs转化为适合测序的文库，包括连接接头、逆转录和PCR扩增等步骤。
4. 高通量测序	使用高通量测序平台（如Illumina）对文库进行测序，获得RPFs的测序数据。
5. 数据处理和分析	对测序数据进行质量控制、比对到参考基因组、识别翻译起始位点和分析翻译效率等。
6. 结果解释和验证	根据分析结果解释翻译过程的特征和调控机制，必要时进行实验验证。