干货分享 | 单抗药物电荷异构体分析和表征（二）在线质谱联用分析和离线纯化后质谱分析
2024-03-22
中科新生命
1608电荷变异体的表征方法
如前文所述，离子交换色谱法(IEX)和毛细管等电聚焦电泳法(icIEF/cIEF)常常用来分离电荷异构体，那么对电荷变异体产生原因的研究，即电荷变异体的表征，同样也是充满挑战。
目前主流思路的主要有在线质谱联用分析和离线纯化后质谱分析。
在线质谱联用分析
在线质谱联用分析主要采用IEX质谱联用(IEX-MS)和电泳质谱联用(CE-MS)进行电荷变异体完整或亚基分子量检测，根据酸碱组分与主峰的分子量差异，推测其所含修饰和产生原因。
作为经典的电荷异构体表征的分析技术，IEX主要基于在某一pH缓冲溶液中，电荷变异体与主峰成分的表面电荷差异导致与色谱柱固定相的结合力存在差异，采用盐浓度梯度、pH梯度或两种梯度并行来实现电荷变异体与主峰成分的分离。由于这类色谱方法，通常需要采用高盐缓冲液，与质谱不兼容，所以需要使用可挥发性盐（如铵盐类），并经方法开发后才可以在实现液相上分离的同时兼容质谱检测鉴定。
Florian Füssl, Anne Trappe, Ken Cook, Kai Scheffler, Oliver Fitzgerald &Jonathan Bones (2019) Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap mass spectrometry, mAbs, 11:1, 116-128, DOI: 10.1080/19420862.2018.1531664
电泳质谱联用(CE-MS)是近年来基于毛细管区带电泳技术(CZE)发展起来的新技术。目前主要有致力于离子源和独特毛细管开发，采用电渗流驱动的鞘液辅助实现离子化，可以获得高灵敏度和分辨率的检测方法；也有将毛细管电泳 (CE) 和电喷雾电离 (ESI) 集成到单个微流体装置中，从而可快速制备和分离生物样品并以电喷雾的形式将其直接喷射到质谱仪中的微流体芯片解决方案。
IEX-MS和CE-MS均可实现电荷异构体的直接分离后实时分子量检测鉴定，但这两种方法也有一定的局限性：
使用IEX-MS和CE-MS进行直接分析时，只能从完整分子量或亚单位分子量的角度区分异构体，这会导致较大的定性误差。
这两种方法需要少量样品，并且不易用于在线分离和富集以供其他检测使用。
样品高度糖基化可能会影响分离和质谱响应值，而复杂的糖基修饰会增加定性分析的难度。
虽然这两种方法存在不足之处，但由于其实验过程简便且高通量特性，可用于早期对于数据分析要求深度不高的候选分子筛选，还是非常适合的。
离线纯化后质谱分析
首先，此法一般就是指利用经典的离子交换色谱分离电荷变异体，并按照保留时间收集相关酸碱组分，进行浓缩后进行下一步表征分析。IEX方法分离规模虽然可以很容易的按比例放大，以收集足够的样品用于质谱分析和活性分析。，但是该方法还是存在如下挑战：
IEX往往组分分离度低，难以实现对每个异构体峰精准分离收集，同时。
富集过程耗时耗力。，低丰度组分收集后体积大，浓度低，大部分情况还需要二次纯化以提升纯度，富集效率极低。
部分电荷变变异体组分稳定性差：修饰可逆（比如琥珀酰亚胺修饰等），容易受pH、温度等影响。
中科新生命作为生物医药CMC药学质量研究专家 ，敢于迎接挑战，承接并完成了几十个抗体电荷变异体的离线纯化后质谱分析项目，并由此总结出了一套行之有效的分析工作流程。
单抗电荷变异体一般分析流程
通过上述抗体表征流程，可以自上而下(Top down)、自中而下或上(middle-down and -up)、自下而上(bottom-up)，从抗体的各个特征结构，如完整抗体、片段（轻链和重链；Fab和Fc）以及肽/糖肽图谱分析其相关翻译后修饰，从而全面解析其电荷变异体产生的原因。
此外，随着近年来icIEF和cIEF广泛用于电荷异质性的检测分析，对于分离所得的电荷变异体的表征需求越来越多，由于前述提到的在线质谱联用法无法满足各种表征分析的需求。故各大仪器厂商也不断致力于研发相关设备，来收集纯化相关分离所得的电荷变异体组分。目前发展比较成熟的有自由流电泳技术(FFE)和基于毛细管等电聚焦技术的蛋白分级设备MauriceFlex。
自由流电泳(FFE)是一种高分率的电荷异构体分案制备工具，在达到icIEF的分辨率的同时，单次实验分离量可以达至100mg蛋白，整个分离过程在液体中进行以便进行下一步的溶剂交换，且保留蛋白的天然构象，分离的异构体可以进行进一步的结构或生物学活性研究。
自由流电泳(FFE)分离蛋白原理
MauriceFlex设备是在原先icIEF电荷变异体分离的基础上，引入醋酸铵改变了 pH 梯度，使这些分开的蛋白质移动并导致洗脱（分级）。
MauriceFlex分离蛋白原理
