干货分享 | LNP原辅料表征放行

1.     引文

RNA药物在疫苗和遗传疾病、肿瘤类疾病治疗方面已经取得了重大突破和具有巨大潜力。脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)在脂质载体给药系统中具有重要地位，其作为递送工具在疫苗方面的成功应用也令其在细胞基因治疗行业具备应用价值。

图1   LNP结构示意图和各原辅料在LNP中的分布

作为药物安全性和有效性的基石，LNP原辅料的质量控制和表征检测也是包括研发人员在内的从业者需要重点关注和研究的内容。

2.     LNP原辅料

组成LNP的原辅料大致有以下几类：可电离的阳离子脂质、中性磷脂、胆固醇、PEG化脂质。以已获批上市的mRNA-LNP疫苗（mRNA-LNP COVID-19 vaccines BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273）为例，其中占比为可电离的阳离子脂质＞胆固醇＞中性磷脂＞PEG化脂质，且四大组分比例相对固定。

表1   列举的产品中LNP组成的比较

3.     脂质体原辅料质量控制

在CDE发布的《脂质体药物质量控制研究技术指导原则（征求意见稿）》中关于脂质体结构或功能性成分的表征部分就指出，对于磷脂应基于波谱学和色谱学等技术证明其结构，并明确指出脂质的组成。在脂质体结构或功能性成分的质量标准部分指出，质量标准应包括鉴别、含量、杂质和其他关键检项。

在脂质体原辅料入场使用前应该进行质量控制已经是通行做法，但同一种原辅料，由于生产厂家的不同，出厂放行检测项目不尽一致。因此造成了各个药品生产企业在使用同样结构的原辅料时，入场质控检测的质量良莠不齐。同时脂质体原辅料具有结构繁多、总体检项数量庞大特点。在此背景下，中科新生命（APT）开发了基于可电离阳离子脂质、中性磷脂、PEG化脂质几大类物质的全检工作流。其内容覆盖：外观和基本性状（外观、可见异物、不溶性微粒）、理化鉴别和理化性质检测（质谱鉴别、红外鉴别、核磁谱鉴别、水分）、杂质鉴定（溶血磷脂的检测、游离脂肪酸的检测、脂肪酸饱和度的检测、特定结构杂质的个性化检测、金属离子杂质检测、重金属检测、溶剂残留检测）、含量和纯度检测、微生物和内毒控制（控制菌检查、内毒素检查）等。

4.     相关案例

原辅料鉴别——质谱、核磁

中科新生命通过LC-MS方法和核磁H-NMR对阳离子脂质原料药进行鉴别，分子量和核磁结果符合预期结构。

图2   核磁谱a）和质谱分子量b）鉴别

原辅料鉴别——分散系数和分子量

利用APT开发的GPC方法检测PEG化脂质的分子量和分散系数，结果如图3所示。

图3   样品GPC色谱图（RI）

表2   PEG化脂质的GPC法计算分子量和分散系数

原辅料纯度检测

利用APT开发的UPLC-CAD方法检测阳离子脂质纯度，结果如图4所示。

图4   阳离子脂质纯度检测色谱图

原辅料杂质控制——中性磷脂中特定杂质限度检测

二脂酰磷脂酰胆碱结构的中性脂质，其中单脂肪酸酯结构可能引起红细胞破裂，本方法可确定杂质是否超限。中性磷脂中杂质如图5所示。

图5   中性磷脂的杂质色谱图

原辅料结构性杂质控制

中性磷脂结构中脂肪酸的不饱和结构限度控制。中科新生命开发了LC-MS检测的流程确认中性磷脂中的油酸和亚油酸结构及限度。

图6   标准品和样本检测质谱图

中科新生命开发了针对LNP各辅料的包含方法开发、验证、放行检测的完整全检流程以支持相关制药实验室的相关业务需求。

参考文献：

1.      Schoenmaker L, Witzigmann D, Kulkarni JA, et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 2021;601:120586. doi:10.1016/j.ijpharm.2021.120586

2.      CDE，《脂质体药物质量控制研究技术指导原则（征求意见稿）》2023