解读16S rRNA测序：揭开微生物世界的奥秘

16S rRNA（16S ribosomal RNA）是一种核糖体RNA，存在于细菌和古细菌等微生物细胞中。它是核糖体的组成部分之一，具有特定的序列和结构。16S rRNA在细胞内充当核糖体的一部分，参与蛋白质合成的过程。

 

一、16S rRNA测序的意义和用途：

 

16S rRNA测序是一种分子生物学技术，用于分析微生物群落中不同微生物的存在和多样性。这项技术之所以如此重要，具有以下几个方面的用途和意义：

1. 微生物鉴定和分类： 微生物世界中存在着大量的微生物种类，有些是致病菌，而有些是有益菌。通过测序微生物样本中的16S rRNA，科学家们可以确定不同微生物的存在，鉴定它们，并将其分类到不同的系统发育群体中。这有助于了解微生物的身份和关系。

2. 微生物多样性研究： 微生物多样性是指某一生态系统或环境中存在的各种微生物种类的多样性和相对丰度。通过对不同环境样本中的16S rRNA进行测序，可以研究微生物多样性，了解不同微生物在生态系统中的分布和影响。

3. 疾病研究： 16S rRNA测序可以用于研究与疾病有关的微生物，例如，肠道微生物与肠炎病变的关联。通过测定疾病患者和健康人群的微生物群落差异，可以探索微生物在疾病发展中的作用。

4. 生态学研究： 16S rRNA测序有助于了解微生物在各种生态系统中的角色和相互作用。这对于环境保护、土壤改良和生态系统管理具有重要意义。

5. 基因功能预测： 通过分析16S rRNA序列，可以预测微生物的一些功能和代谢能力。这有助于理解微生物在不同环境中的生存策略。

 

二、16S rRNA和16S rDNA的区别

 

（1）.16S rRNA（核糖体RNA）：

1. 存在状态： 16S rRNA存在于活跃的微生物细胞中，以及其他核糖体RNA的一部分。

2. 功能： 16S rRNA在微生物细胞中充当核糖体的一部分，参与蛋白质合成的过程。

3. 特点： 具有高度保守的序列，这意味着在微生物领域中，16S rRNA的某些区域的序列相对稳定，不容易发生变异。这些保守的区域通常用于微生物分类和系统发育研究，因为它们足够相似，以便进行比较。

 

（2）.16S rDNA（核糖体DNA）：

1. 存在状态： 16S rDNA存在于微生物细胞的DNA中，包括活跃和不活跃的微生物细胞。

2. 功能： 16S rDNA是微生物细胞的遗传物质，其中包含编码16S rRNA的基因序列。它不直接参与蛋白质合成，但包含了产生16S rRNA的遗传信息。

3. 特点： 与16S rRNA相比，16S rDNA的序列可以变化，因为它们在细胞复制和遗传过程中会发生突变。因此，测序16S rDNA通常用于分析微生物的遗传多样性，例如，通过比较不同微生物株的16S rDNA序列来研究它们之间的遗传关系。

 

三、16S rRNA测序过程的简要描述

 

步骤	描述
1. 样本采集	从不同来源采集包含微生物的样本。
2. DNA提取	使用DNA提取试剂盒或自制方法从样本中提取总DNA。
3. PCR扩增	使用16S rRNA引物进行PCR扩增，选择性地放大16S rRNA基因。
4. 测序	使用Sanger测序、高通量测序（如Illumina MiSeq）或第三代测序技术（如PacBio）测序16S rRNA基因。
5. 序列数据处理	去除低质量序列、剪切引物和接头序列，配对序列（如果适用）。
6. OTU聚类或ASV分析	将相似的序列进行OTU聚类或ASV分析，确定微生物分类单元。
7. 物种注释	将序列与16S rRNA数据库中的参考序列比对，注释微生物物种。
8. 生态学分析	进行多样性分析、物种组成分析、群落结构分析等生态学研究。
9. 数据解释	结合研究问题和实验设计，解释微生物群落的结构和功能。

 

四、测序不同方法的优缺点

 

方法	优点	缺点
Sanger测序	- 准确性较高。 适用于短序列。	- 测序速度较慢。 不适用于高通量分析。 成本较高。
454测序（pyrosequencing）	- 适用于长序列。 相对较快的测序速度。 适用于高通量测序。	- 有偏差（homopolymer regions）问题。 较高的错误率。 成本较高。
Illumina测序	- 高通量测序，适用于大规模项目。 低错误率。 成本相对较低。	- 无法测序超长序列。 对GC含量敏感。 生成的短序列需要拼接。
PacBio测序	- 高通量测序，适用于长序列。 单分子测序，准确性高。 适用于多样性研究。	- 仪器成本较高。 测序错误率相对较高。 数据处理复杂。
Oxford Nanopore测序	- 高通量测序，适用于长序列。 单分子测序，实时分析。 可以检测DNA修饰。	- 测序错误率相对较高。 仪器成本较高。

 

 

五、16S rRNA测序的应用案例

 

2023年11月，上海交通大学医学院附属瑞金医院汤荟冬/江旭峰/张淼教授合作在Gut Microbes（IF 12.2）上发表题为“Multi-omics data reveals aberrant gut microbiota-host glycerophospholipid metabolism in association with neuroinflammation in APP/PS1 mice”的文章，该研究不仅利用16S rRNA基因测序和代谢组学探讨了AD小鼠肠道微生物丰度和血清代谢丰度的变化特征，还结合空间代谢组学、转录组学、神经影像学和病理学研究了大脑的变化并确定了它们间的相关性。该研究为阐明AD中微生物群-肠-脑轴的机制提供了更直接的证据。中科新生命为该研究提供了16S rRNA测序、非靶向代谢组学、空间代谢组学以及转录组学等技术服务。

 

 技术路线

步骤1：使用Morris水迷宫实验测定各组（n=11）的认知水平；

步骤2：采用PET-CT检测小鼠脑内Aβ斑块和神经炎症水平（n=3）；

步骤3：收集粪便和血清样本分别进行16S rRNA测序（n=8）和非靶向代谢组学（n=8）分析；

步骤4：脑组织样本进行空间代谢组学（n=3）、免疫荧光（n=6）、转录组（n=3）和PCR（n=3）分析；

步骤5：整合多组学数据进行相关分析，以探索肠道微生物群与大脑之间的相互作用；

步骤6：选择APP/PS1小鼠（n=6）进行粪便移植（FMT）干预验证多组学结果。

 

 

图1 实验设计

 

 其中使用16S rRNA检测流程的结果

 

APP/PS1和WT小鼠肠道微生物丰度的差异

为了研究APP/PS1和WT小鼠肠道微生物丰度的差异，收集两组粪便样本进行16S rRNA检测。Simpson多样性显示两组小鼠肠道微生物群的α多样性没有显著差异，PCoA分析显示两组小鼠之间的β多样性没有显著差异。进一步比较两组小鼠肠道菌群在属水平上的差异，发现APP/PS1小鼠组中脱硫弧菌、肠球菌、图里克氏菌和瘤胃球菌的丰度有所下降，假单胞菌丰度增加。

 

图 APP/PS1和WT小鼠肠道微生物丰度的差异

 

 

 

 小结

总的来说，本研究整合多组学（16S rRNA测序和代谢组学、空间代谢组学和转录组学）结果，描述了APP/PS1 AD小鼠模型中肠道微生物群丰度、血清和大脑中的甘油磷脂代谢以及大脑中的神经炎症通路的变化情况，并通过整合分析以及粪便移植（FMT）干预揭示了 APP/PS1小鼠肠道微生物群、宿主甘油磷脂代谢和神经炎症水平之间的潜在关联，本研究促进了我们对于肠道微生物群与AD之间关系的理解。