Cell | 空间多组学揭示TCF4依赖性基因调控网络赋予黑色素瘤对免疫治疗的耐药性
2024-01-11
中科新生命
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转移性黑色素瘤（Metastatic melanoma ，MM）的新型治疗策略开发仍然是一个临床挑战。尽管自引入免疫检查点阻断（ICB）以来，治疗结果有所改善，但一半的MM患者没有获得持久的生存获益，阐明ICB疗法（如抗PD-1和/或抗CTLA-4）并非对所有患者都有效的原因至关重要。
2024年1月4日，比利时鲁汶大学VIB KU Leuven癌症生物学中心等机构的研究人员在Cell（IF 64.5）上发表题为“A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma”的文章，利用单细胞转录组学、空间多组学技术发现依赖于转录因子TCF4的基因调控网络使黑色素瘤对免疫疗法产生抗药性，增强了人们对初治黑色素瘤生态系统的细胞结构及其在ICB治疗下演变过程的全面了解。
研究材料
研究纳入接受抗PD-1单药治疗（n=17）或抗PD-1/抗CTLA-4联合治疗（n=6）的初治III/IV期MM患者，获得了20名患者在ICB治疗前（BT）和早期治疗（OT）的两个时间点的皮肤、皮下或淋巴结转移的病变匹配组织
技术路线
步骤1：初治人类黑色素瘤含有处于MES（mesenchymal-like）状态的癌细胞；
步骤2：MES状态细胞富集于ICB难治性早期治疗的黑色素瘤中；
步骤3：转录因子TCF4促进MES，同时抑制黑素细胞形成（melanocytic）和抗原呈递程序；
步骤4：靶向TCF4表达可增加对ICB和靶向治疗的敏感性。
研究结果
1. 描绘初治黑色素瘤单细胞转录组学景观
研究首先利用小鼠黑色素瘤scRNA-seq数据集确定7种黑色素瘤细胞状态，其中6个簇与人类黑色素瘤scRNA-seq中鉴定的细胞状态重叠—黑素细胞（MEL）、间充质样（MES）、抗原呈递、神经嵴样、应激（缺氧）和应激（p53反应）。之前描述的标记基因，如NGFR、VEGFA、COL5A1分别在神经嵴样细胞、应激（缺氧反应）细胞、MES细胞中被鉴定出来。此外，神经嵴样细胞状态和MES细胞状态是最去分化的状态，且特定细胞状态的丰度与BRAF和NRAS突变状态之间没有关联，这表明具有不同遗传特征的黑色素瘤细胞可以表现出重叠的转录程序。
图1 完善初治人类黑色素瘤转录组学景观
2. 黑色素瘤细胞状态多样性的空间映射
为了深入了解黑色素瘤生态系统的空间组织，研究进行了非靶向空间分辨转录组学。使用CellTrek将空间转录组学数据与scRNA-seq数据整合，证实了这些完整临床样本中存在各种黑色素瘤细胞状态，包括缺氧和 p53 反应状态等。此外，利用scRNA-seq数据在携带抗原呈递状态的恶性细胞百分比与活化的CD8 T细胞之间建立了显著的正相关关系，细胞间通讯网络分析预测了抗原呈递细胞状态与免疫细胞群之间的功能相互作用。最后利用多重免疫组化（mIHC）验证了这两种细胞类型之间的空间关系，邻域分析证实在CD8 T细胞附近，MHC II类标志物HLA-DR阳性的黑色素瘤细胞富集。
图2 在空间上绘制的初治黑色素瘤生态系统
3. 黑色素瘤MES细胞的明确检测
具有MES表型的黑色素瘤细胞与正常间充质细胞（包括肿瘤相关成纤维细胞CAF）非常相似。研究列出了黑色素瘤MES细胞和CAF之间差异表达最多的50个基因，称之为最小谱系基因（MLG），用来定义黑色素瘤特异性MES基因特征。MLG提供了一种独特的工具来明确区分黑色素瘤MES细胞和CAF。由于MLG在MES细胞中的表达较低，研究人员开发了一种原位绘制MES单元的方法（RNAscope，与CODEX 兼容），采用该方法证实高比例的MES细胞的存在，这些数据提供了在scRNA-seq数据集和组织切片中明确识别黑色素瘤MES细胞的方法，并确定这些细胞在初治人类黑色素瘤中的存在。
图3 黑色素瘤MES细胞的鉴定和原位定位
4. MES细胞富集于ICB非响应的早期治疗的黑色素瘤中
研究人员接着探究ICB治疗一个周期如何重塑黑色素瘤转录景观，发现抗原呈递和MES状态与不同的临床反应相关。配对分析显示，响应（R）和非响应（NR）的OT样本中分别呈现抗原呈递和MES细胞增加的趋势，且这些细胞群的存在显示出反应预测的良好诊断性能。随后利用多重免疫组化（mIHC）和CODEX/RNAscop方法验证了NR的OT样品中MES细胞丰度增加，结果与scRNA-seq数据一致。结果表明来自黑色素瘤的早期OT样本中存在MES细胞预示着对ICB缺乏响应。
图4 黑色素瘤MES状态与对ICB的反应有关
5. TCF4协调多个黑色素瘤转录程序
由于TCF4在黑色素瘤MES细胞中特异性表达和活跃，研究推断TCF4可能控制黑色素瘤MES细胞中重叠的转录网络，于是在携带MES表型的黑色素瘤细胞系（MM047和MM099）中敲低TCF4，发现TCF4敲低后下调的基因参与细胞运动、EMT、整合素信号传导和血管生成，且TCF4敲低使MM099和MM047细胞对BRAF和MEK抑制剂敏感。因此TCF4有助于维持MES表型和对靶向治疗的耐药性。此外，许多参与免疫应答的基因在TCF4敲低后上调，这些数据表明，TCF4主动抑制抗原呈递等转录程序，从而可能直接促进免疫细胞逃避，对免疫治疗的耐药性。
图5 TCF4协调多个黑色素瘤转录程序
6. 通过BET抑制靶向TCF4表达
使用ATAC-seq测序对转座酶可及染色质进行批量测定显示，在携带MES或中间表型（如MM057）的黑色素瘤细胞中，溴结构域和超末端结构域（BET）蛋白BRD4可结合TCF4增强子区域。而MM057细胞暴露于ARV-771（BET降解剂）会降低TCF4上游的染色质可及性，降低MES细胞和MM057细胞中TCF4的表达，引起下游一系列基因的转录变化，且种转录变化伴随着对BRAF和MEK抑制剂的敏感性增加。因此，BET抑制可能是增加MES免疫原性及其对ICB敏感性的临床兼容途径。
图6 通过BET抑制靶向TCF4
小编小结
为了更好地理解免疫检查点阻断疗法（ICB）的内在耐药性，研究人员建立了一个治疗无效黑色素瘤生态系统细胞构成的全面视图，并研究了它在ICB作用下的演变。研究利用单细胞测序联合空间多组学研究表明，肿瘤微环境促进了复杂的黑色素瘤转录组景观的出现，黑色素瘤细胞具有间质样（MES）状态，这种细胞群已知会对靶向治疗产生抗药性，它们在ICB非应答者的早期治疗活检中明显富集。TCF4是MES特征的核心调控因子，也是黑色素细胞和抗原递呈转录程序的抑制因子，是这一特征的枢纽，使用溴域抑制剂在基因上或药理学上靶向TCF4可增加MES细胞的免疫原性和对ICB及靶向治疗的敏感性。
图7 黑色素瘤对免疫治疗的耐药性的机制模式图
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