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项目文章Nat Commun | 徐州医科大学通过磷酸化蛋白质组揭示血小板线粒体氧化损伤修复的新机制

2024-01-10

中科新生命

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Human MutT Homolog 1（MTH1）是一种核苷酸焦磷酸酶，可水解氧化的核苷酸以防止其在氧化应激下错误结合到DNA中，但关于MTH1在血小板中的表达和功能作用尚不清楚。

2023年8月，徐州医科大学血液病研究所乔建林/徐开林/曾令宇团队在Nature Communications（IF 16.6）上发表了题为“MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis”的研究论文，揭示了血小板线粒体氧化损伤修复的新机制。中科新生命为其提供了磷酸化蛋白质组学检测的技术服务。

研究材料

MTH1flox/flox小鼠、PF4-CRE小鼠和野生型小鼠以及人的血小板

技术路线

步骤1：MTH1敲除小鼠体内出血和血栓检测；

步骤2：MTH1敲除小鼠体外血小板功能检测；

步骤3：MTH1敲除小鼠血小板线粒体氧化损伤检测；

步骤4：MTH1敲除小鼠磷酸化蛋白组学检测；

步骤5：MTH1缺陷降低了mtdna编码基因的表达。

研究结果

1. MTH1在血小板线粒体中表达，其缺乏会损害体内止血和血栓形成

为了探索MTH1是否在血小板内表达，研究者基于WB证实MTH1在血小板内表达，并基于分数免疫印迹法和免疫电镜分析证实MTH1定位于线粒体。为进一步研究MTH1的功能，构建了巨核细胞/血小板特异性MTH1敲除小鼠，发现MTH1缺乏会损害血小板止血功能，影响动脉和静脉血栓形成（图1）。

图1 MTH1在血小板线粒体中表达，在体内调节止血和血栓形成

2. MTH1缺乏抑制GPCR介导的血小板聚集、钙动员和线粒体ATP生成

进一步体外评估MTH1对血小板功能的影响，发现MTH1缺失不影响胶原相关多肽（CRP）（GPVI受体的激动剂）介导的血小板聚集或ATP释放。但可抑制依赖于凝血酶（GPCR受体的激动剂）介导血小板聚集、ATP产生、整合素激活和钙动员等相关的血小板功能（图2）。

图2 MTH1缺乏损害GPCR依赖性血小板聚集、钙动员和线粒体ATP产生

3. MTH1缺失血小板中线粒体DNA氧化损伤增加

然后，研究者评估了MTH1缺乏是否会导致线粒体DNA(mtDNA)的氧化损伤，发现，MTH1缺失显著增加了凝血酶诱导的血小板线粒体氧化损伤，进一步的分析发现，线粒体ROS生成依赖GPCR诱导并且钙信号通路参与线粒体ROS生成，进而引起线粒体氧化损伤（图3）。

图3 MTH1缺失血小板中线粒体DNA氧化损伤增加

4. MTH1缺失血小板中蛋白磷酸化调控失调

研究者进一步通过磷酸化蛋白质组学揭示MTH1缺乏所导致的血小板功能改变的分子调控机制。KEGG分析发现MTH1缺陷血小板中差异磷酸化蛋白主要富集在血小板活化、MAPK和磷脂酰肌醇信号通路，而凝血酶处理后的MTH1-/血小板中p38 MAPK和AKT的磷酸化水平显著降低，PLCβ3 (Ser1105)和RhoA (Ser188)的磷酸化水平显著升高，表明MTH1缺失损害了PLCβ3活性和RhoA激酶信号传导。

为了找到凝血酶介导的MTH1缺乏症的特异性作用，作者重点分析了线粒体磷酸化的功能：发现在MTH1缺失的血小板中，Slirp和Slc25a1磷酸化显著下调，而这两个蛋白，一个参与调控线粒体代谢（Slc25a1），另一个参与调控线粒体蛋白合成（Slirp）（图4）。

图4 凝血酶刺激后MTH1缺陷血小板中蛋白磷酸化异常

5. MTH1敲除显著下调MT-CO1的表达

考虑到MTH1缺乏诱导mtDNA氧化损伤和ATP生成，以及slrp(调节线粒体蛋白合成)磷酸化降低，因此下一步评估了MTH1缺乏是否影响mtDNA编码蛋白的表达，作者发现凝血酶刺激后的MTH1缺陷血小板中细胞色素c氧化酶1(MT-CO1)的蛋白表达水平显著降低。与此一致的是MT-CO1基因表达也降低，主要原因是MT-CO1 DNA中鸟嘌呤含量高于其他mtDNA，使得该基因在MTH1缺陷血小板中DNA复制过程更容易受到氧化损伤。此外也验证了MTH1缺失导致的血小板磷酸化蛋白谱发生变化是受到线粒体的影响（图5）。