体外药代动力学：ADC药物血浆稳定性与体外释放实验
2023-09-28
中科新生命
2300ADC药物是一类新型生物药，与传统化药相比，它具有向肿瘤细胞靶向递送毒性药物的潜力，ADC药物有更强的生物活性（更好的疗效、选择性和治疗指数）和有限的全身暴露。但同时ADC药物也具有更复杂的结构异质性，LC-MS在ADC药物的检测和表征中发挥着越来越重要的功能。
本文将简单介绍ADC药物的血浆稳定性和有效荷载释放（payload release）的体外研究。
一
ADC血浆稳定性体外实验
在已上市的十多种ADC药物中，近一半都采用可切割连接子（cleavable linker）对毒性小分子进行偶联，如Adcetris，Lumoxiti，Polivy等。对于存在cleavable linker的ADC药物来说，可能存在这样的风险，即ADC药物在达到靶细胞之前，在循环中过早释放payload。这可能会产生脱靶毒性，也可能导致递送到靶细胞的毒性分子较少，无法有效杀伤靶细胞，因此在研发早期进行血浆稳定性的评估将有助于尽早地了解ADC的分子，尤其是linker的稳定性，以供研发人员尽早地对ADC进行必要的改造。
血浆稳定性的被分析物包括游离小分子毒素、偶联小分子毒素、偶联抗体、总抗体和DAR值等，具体需要根据研究需求来进行考量。例如通过马来酰亚胺基团偶联半胱氨酸的ADC分子可能通过将整个linker-payload分子转移到血浆白蛋白的游离半胱氨酸上，从而在不增加游离小分子毒素的情况下来降低ADC的DAR值。Russell[1]等人和Li Yi[2]等在测定含有cleavable linker的ACD药物的抗体结合的小分子（conjugated payload）时，用木瓜蛋白酶（papain）代替传统的组织蛋白酶B（cathepsin B）切割Val-Cit二肽linker，释放出payload后，用LC-MS/MS进行定量。
在血浆中直接检测ADC分子的DAR值是最为直接的观察DAR分布变化的手段。通常我们需要从血浆样品中富集目标ADC分子，随后使用高分辨质谱来检测ADC分子的完整分子量或者还原分子量来测定DAR值。除此之外，完整ADC分子的分析还可以观察偶联在抗体上的小分子毒素可能产生的生物转化，以提供更丰富的信息。
二
ADC payload体外释放试验
对于含有cleavable linker的ADC药物，主要通过解偶联代谢来释放payload；而含有non-cleavable linker的ADC药物则通过溶酶体内蛋白酶介导的分解代谢来释放paylaod, 其释放出的payload相关组分并不好预测。因此在ADC药物的早期开发中，确定ADC释放payload的具体形式对于后续的开发过程来说具有非常重要的意义。
ADC药物的体外payload释放实验在肝S9组分、溶酶体环境或者靶细胞的孵育体系中完成。Pfizer的工作人员在体外实验中[3]，将cleavable linker的ADC和non-cleavable linker的ADC在溶酶体环境或者肝S9组分中孵育，模拟体内的代谢情况，将代谢产物用orbitrap高分辨质谱以DDA模式进行采集以鉴定代谢产物。Andrew等使用三重四级杆质谱以中性丢失扫描和前体离子扫描的方式也实现了对溶酶体降解的ADC药物进行代谢产物鉴定[4]。
[1] Antibody-conjugated drug assay for protease-cleavable antibody–drug conjugates
[2] An enzymatic deconjugation method for the analysis of small molecule active drugs on antibody-drug conjugates
[3] Determination of Antibody−Drug Conjugate Released Payload Species Using Directed in Vitro Assays and Mass Spectrometric Interrogation
[4] LC/MS Methods for Studying Lysosomal ADC Catabolism
