HCP抗体覆盖率验证方法：AAE技术的应用
2023-09-28
中科新生命
1536上一讲介绍到传统的基于免疫印迹（Western blot，WB）的HCP抗体覆盖率验证方法，包括双向凝胶电泳-免疫印迹（2-D SDS-PAGE-Western blot, 2D-WB）（见图1）、双向差异荧光印迹（2D differential in blot electrophoresis, 2D-DIBE）等；由于HCP覆盖率低、重复性差等问题，逐渐无法满足NDA、BLA等注册申报的要求。
（图1.Left panel: 2-D IEF/SDS-PAGE analysis of representative CHO HCP calibration standard stained with a sensitive fluorescent. Right panel: Western blot analysis of the same gel shown in the left panel [1]）
2014年， Cygnus结合多年HCP抗体及试剂盒开发经验，推出了抗体亲和富集（Affinity Antibody Extraction，AAE）方法，突破了WB方法的局限性（见表1），进一步更真实准确地反应HCP抗体覆盖率。该方法一经上市，广泛得到生物制药企业和监管部门的认可。
（表1.各HCP覆盖率验证方法对比）
抗体亲和富集 Antibody Affinity Extraction，AAE
AAE旨在克服基于WB方法在评估多克隆抗体对HCP覆盖率方面的技术缺陷，该方法首先将抗HCP抗体偶联到层析填料上，然后上样HCP样品，富集过程中HCP抗体可捕获识别HCP，而未识别的HCP则被流穿，通过多次重复循环，直到没有额外的HCP结合为止；最后通过低pH等条件洗脱、富集HCP。将富集前的HCP和富集后HCP进行二维电泳-染色分析（AAE-2D）或质谱分析（AAE-MS），计算抗体的覆盖率（图2）。
（图2. AAE检测HCP覆盖率实验流程示意图[2]）
抗体亲和富集-二维电泳技术 AAE-2D
AAE提取富集的样品和未经AAE富集的样品可以经过2D PAGE分离后使用银染的方法对得到的点进行匹配、计数、计算覆盖率。使用AAE-2D方法有效解决了传统2D-WB中的低灵敏度和低特异性的问题，因为通过富集不仅可以检测出很多低浓度HCP，还可以大幅降低中间品和终产品中的药物蛋白，并且HCP样本在跑胶之前不需要经过变性处理，检测的抗原更加真实，适用于纯化前和纯化后的样本，真正反应试剂盒对工艺过程中或终产物中残留的HCP覆盖率。以图3为例，使用F550-1 CHO HCP ELISA kit,样品经AAE富集前、后分别鉴定到1176和1005个蛋白点，HCP抗体覆盖率在86%。
（Pre‐AAE Harvest（left） and Post‐AAE （right）
图3.AAE method with 2D-PAGE/silver stain detection - CHO harvest sample was loaded on an AAE column with anti-CHO HCP antibody）
抗体亲和富集-质谱分析 AAE-MS
质谱法是鉴定HCP的一种非常强大的工具，但单纯的MS分析HCP的局限性之一是高丰度（10⁴-10⁶倍）的产品蛋白常掩盖了HCPs的信号，干扰分析结果。与质谱（MS）联用，是基于AAE技术的另一种新颖、可靠的HCP抗体覆盖率分析方法。通过AAE样品制备方法，富集HCPs的同时，可以有效消除样品中的大部分产品蛋白。AAE富集HCPs和质谱检测HCPs是两种互补的正交方法，甚至可以用于鉴定产品中存在的单个HCP，并有助于决定检测结果是否适合于工艺监测和产品批次放行。
AAE-MS的优势是不仅可以准确鉴定HCP样品中包含的蛋白种类和相对丰度，提供其分子量（MW）和等电点（pI）等信息，而且可以结合HCP多抗能识别的蛋白质种类，通过两者匹配计算得到更真实的覆盖率（~90%），见图4。
（图4. Virtual 2D-PAGE of the HCP immunogen based on MS-protein identifica-tions. Identified proteins were plotted by database molecular weight and pI. spot size is scaled to relative protein abundance as determined by Mascot emPAI. Null cell HCPs span the molecular weight range from »5 to 450 kDa with pls ranging from 3–12.）
生物制品中残留的HCP通常被认为是关键的质量属性（CQA），对工艺开发和生产中的HCP进行监控显得尤为重要。上海中科新生命生物科技有限公司（APTBIO）早在 2005和2006年就与Cytiva（原GE Healthcare）联合举办了第一届和第二届双向凝胶电泳和DIGE技术培训班，具有近20年的HCP抗体覆盖率商业服务经验。随着技术的更迭，APTBIO平台目前同时具备2D-WB、AAE-2D、AAE-MS等不同的HCP抗体覆盖率验证解决方案，期待为广大客户提供个性化定制产品服务。
参考文献
[1].The United States Pharmacopieial Convention. USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals [M].
[2] Alla Zilberman HCP ELISA and HCP Antibody Coverage Analysis Methods. 2021.
[3] Henry S M, et al. ELISA reagent coverage evaluation by affinity purification tandem mass spectrometry[J]. Mabs, 2017:1065-1075.
