肿瘤新生抗原鉴定，免疫治疗新方向

肿瘤新生抗原是一类由肿瘤细胞特异性表达的抗原，来源于肿瘤细胞内发生突变的基因，在细胞内经过复杂的表达和加工过程后，与主要组织相容性复合物（major histocomp atibility complex, MHC）分子以结合的形式呈现在细胞表面，并被T细胞所识别，从而激活机体的免疫系统，引起一系列免疫应答反应并清除肿瘤细胞^[1]（如图1 ）。

肿瘤新抗原的发现和优化是推进下一代癌症免疫治疗不可或缺的组成部分。与肿瘤相关抗原不同，肿瘤相关抗原被癌症细胞过度表达，但也存在于正常或免疫原性组织中，新抗原是肿瘤特异性的，并被适应性免疫系统识别为外来表位。

因此，肿瘤新抗原可以激活不受免疫耐受影响的高亲和力细胞毒性T淋巴细胞（CTL），并且避免对非肿瘤组织造成“脱靶”损伤。这些特点使得肿瘤新生抗原成为肿瘤免疫治疗的理想靶点，具有广泛的治疗前景和临床应用价值^[2]。

图1. 肿瘤新生抗原的加工和在MHC-I分子上的呈递过程

根据美国临床试验数据库，目前涉及新生抗原疫苗的研究共129项临床研究，欧美企业领头新生抗原疫苗的研发，代表性公司包括BioNTech、Neon Therapeutics、Gristone Oncology等。中国企业紧跟其后，代表性公司有华大吉诺因、裕策生物、纽安津生物、新合生物、立康生命科技等。新生抗原疗法正在覆盖更广泛的癌症类型，特别是实体瘤，其中前三适应症分别为黑色素瘤、乳腺癌及肺癌。此外，新生抗原疫苗通过与ICIs或化疗等结合使用的联合疗法更为普遍。整体而言，全球新生抗原疗法行业仍然处于实验研究阶段，尚无产品上市。

新生抗原在众多临床试验中收获了良好的治疗效果，其中代表性工作层出不穷。据报道，在临床研究（NCT03185429）中，一例66岁的转移性胃癌患者在接受个性化的载有新生抗原的单核细胞衍生的树突状细胞疫苗 (Neo-MoDC) 疫苗后产生了较强的T细胞反应，联合免疫检查点抑制剂nivolumab（纳武单抗）后引发更强的免疫反应，从而使所有肿瘤完全消退（图2），截止到2021年10月，该患者已持续完全缓解超25个月^[3]；然后，Neon公司开发的NEO-PV-01是一种“量身定制”的个体化新抗原疫苗。在早期临床试验（NCT02897765）中延长了黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）和膀胱癌患者的无进展生存期^[4]。这一结果，揭示了癌症疫苗这一创新免疫治疗模式的潜力。此外，2021年1月，国际顶级癌症期刊Nature medicine发布的一项1期临床研究中（NCT01970358）显示，8例晚期黑色素瘤、手术后有高复发风险的患者，在接受个性化的NeoVax疫苗治疗后，由疫苗引发的控制肿瘤生长的免疫反应已经持续超4年（56个月），8例患者的病情目前均无进展^[5]。

在国内，新生抗原相关研究也发展迅猛。首先是2020年1月，华大吉诺因宣布自己的“靶向新生抗原自体免疫T细胞注射液Neo-T”临床试验申请，已经获得了国家药监局CDE的临床试验默示许可。今年，纽安津、新合和立康三家公司的新生抗原疫苗的新药临床实验申请先后获得CDE受理，其疫苗形式分别为多肽疫苗、mRNA疫苗和mRNA-DC疫苗。

虽然新生抗原疫苗疗法作为癌症免疫治疗的新方法，使得患者的免疫细胞能够特异性地精准攻击肿瘤细胞。但目前已进行和提交的临床试验大多处于1期状态，一些制药公司正在尝试进行更多的2期试验。随着更多的科学和临床数据揭示基于新生抗原疫苗疗法在多种癌症类型中的疗效，以及对新生抗原生物学特性的更好理解，我们相信基于新生抗原的疗法是癌症免疫疗法中很有前景的领域，将掀开肿瘤个性化免疫治疗的新篇章。

1988年De Plaen等人^[6]利用cDNA文库筛选，在小鼠肿瘤模型中发现了第一个可以被T细胞识别的新生抗原。文章中表明，正常基因和肿瘤基因之间只有一个核苷酸的差异，这个突变导致产生了一个氨基酸的变化。肿瘤体细胞突变的来源非常广泛，我们必须对这些突变序列进行预测，筛选出最能够特异性引起机体免疫应答反应的候选新生抗原，这是个性化肿瘤免疫治疗应用中极为关键的环节。

2012年，NGS技术首次被报道应用于小鼠肿瘤模型中新生抗原的鉴定，并很快得到广泛应用^[7]。目前，基于全外显子组测序（WES）技术和不断优化的生物信息学筛选算法，科学家们已经发现了很多新生抗原。在该技术中，经典的方案是首先在得到患者的肿瘤组织和正常组织后，通过高通量测序技术初步识别肿瘤体细胞中的突变序列，再借助经过训练的AI算法预测潜在的肿瘤新生抗原。当然，在预测的这一过程中需要考虑多方面因素，包括HLA分型、蛋白酶体剪切、TCR结合力、MHC亲和力、肿瘤新抗原来源等；此外，还包括用来评估T细胞反应的相关因素，如T细胞识别、TCR分析等^[8]。

虽然目前AI算法预测的准确度经过大量科学家和越来越多的验证性数据集的持续训练，其准确度已经大大提升，但是如何从潜在的不相关的新生抗原中准确且灵敏地识别出真正具有靶向作用的新生抗原仍然是一大挑战，通常科学家们还是要结合体外实验去验证潜在的新生抗原是否具有活性，是否真正能够引发患者的抗肿瘤反应。因此进一步提高算法的准确性极为关键，其中数据类型、质量和数量都会极大地影响算法的精度。通过数据库的不断积累，尤其是经过验证的肿瘤新抗原数据，以期望可以进一步推进该类新生抗原预测技术的准确性。

图3. 结合肿瘤WES鉴定新生抗原的路线图

近年来，基于质谱法检测新生抗原的技术在许多文献中得到了应用^[9-10]。质谱法可以直接鉴定真实呈递在肿瘤细胞表面的新生抗原肽段，其鉴定的原理是将肿瘤细胞表面的抗原肽从HLA分子上洗脱下来，采用质谱对其直接进行测序。

目前的质谱技术可以从细胞系和患者临床样本中识别数千个MHC呈递的多肽序列^[9]。质谱分析法用于新生抗原筛选的一个优势是它极大缩小了新生抗原的候选范围，并且是一个不带偏向性的方法，可以极大地提高新生抗原的筛选准确性^[11-12]。质谱法直接测定到的具有免疫原性的新生抗原序列可能与HLA没有那么高的亲和力，因此基因测序方式可能无法发现这类有真实功能的新生抗原^[13-14]。此外，它还具有发现非典型肿瘤特异性HLA多肽的能力^[15]。研究表明非典型肿瘤特异性HLA多肽有更大的可能性作为新生抗原靶点，而NGS是基于蛋白编码区，主要关注的是SNVs等典型肿瘤抗原，而不能充分评估其他非典型肿瘤抗原，但质谱检测法能够定位不能从NGS中预测得到的非典型多肽，如蛋白酶体剪切的肽段、由非编码区翻译的肽段及翻译后修饰PTMs的肽段等；其中，PTMs对MHC抗原加工和呈递有影响，而PTMs不能通过基因组/转录组测序中预测，因此肿瘤新生抗原的PTMs鉴定也依赖于质谱技术。

最后，如果对预测的靶标肿瘤抗原在样本内的绝对表达量值感兴趣，可以通过合成同位素肽段结合质谱定量技术实现，该方法具有极高的灵敏度和准确性^[16]。

图4. 结合质谱法检测新生抗原的路线图

免疫疗法已成为癌症治疗的关键方式之一，免疫检查点抑制ICI和其他形式的免疫治疗使许多患者的生存率明显提高，但只有一小部分患者从免疫疗法中受益。因此，理解抗肿瘤免疫反应的分子基础，如肿瘤如何被T细胞识别也成为目前免疫治疗的重点方向。相较于检查点抑制剂、CAR-T等经验丰富的细胞疗法，新抗原疫苗在癌症免疫治疗领域仍然还处于快速发展期，并且其发展中仍面临许多挑战，如：如何寻求鉴定更有效的新生抗原方法、改进预测新抗原的筛选方法提高准确性、开发不同肿瘤疫苗的递送技术等等。

但近年来，随着越来越多相关基础研究和临床试验的展开，基于肿瘤新生抗原的免疫疗法在临床试验中已显示出非常良好的治疗效果，我们有理由相信，基于肿瘤新生抗原的疗法是癌症免疫疗法中非常有前景的领域，并将最终惠及肿瘤患者。