16SrRNA基因与宏基因组测序：微生物种属鉴定检测方法

16S rRNA基因普遍存在于所有细菌和古细菌中，其基因全长约1500bp，包含9个高可变区和10个保守区（图1）^[1]。16S扩增子测序是基于16S rRNA基因，通过PCR扩增的方式，获取16S rRNA基因的部分区域或全长序列。这些序列信息可以用于鉴定微生物的种类和数量，研究微生物群落的结构和多样性。

目前针对16S扩增子测序来说，二代高通量测序是比较常用的方法，但是受限于测序读长，因此需要对扩增区域进行选择，那么我们该如何选择扩增区域呢？地球微生物组计划（Earth Microbiome Project，EMP）推荐的标准引物是扩增 V4−V5 区的515F/806R 引物对和扩增 V4−V6 区的 515F/926R 引物对（表1）。有研究人员对16S扩增子测序中常用的引物进行评估，发现16S rRNA 基因的 V4−V6 区特异性好、数据库信息全，EMP推荐的引物具有高覆盖度和特异性，成为细菌多样性分析注释的最佳选择^[2]。

与16S扩增子测序不同，宏基因组测序是直接测序微生物DNA的所有基因。这种方法可以获得微生物的全基因组序列。通过分析这些序列，可以研究微生物的基因组结构和功能。宏基因组测序可以用于研究微生物的代谢途径、抗药性和毒性等方面的功能。16S扩增子测序和宏基因组测序各都有其优缺点。16S扩增子测序可以快速、准确地鉴定微生物的种类和数量，但是一般只能鉴定到属水平，无法准确到种或亚种水平。宏基因组测序是获得微生物的全基因组信息，可以鉴定到种或亚种水平，但是测序成本相比16S较高。因此，在选择微生物检测方法时，应根据研究目的和预算选择合适的方法。

下面重点介绍一下宏基因组（Metagenomic），宏基因组测序是对样本中所有的微生物DNA进行高通量测序，经过序列处理分析，可以识别微生物群落的物种结构，进化关系，甚至微生物群体的功能活性，探究致病或耐药性等分子机制，挖掘具有研究价值的分子通路等。宏基因组测序及分析流程（图2）包括样本收集、DNA提取、文库构建及上机测序、序列组装、分箱、丰度和差异分析和个性化的高级分析等^[3]。

在实际应用中，16S扩增子测序和宏基因组测序都有很多应用。例如，16S扩增子测序可以用于研究不同环境中微生物群落的多样性和结构，如土壤、水体、动物肠道等。宏基因组测序可以用于研究微生物的代谢途径、抗药性和毒性等方面的功能，如研究肠道微生物对人体健康的影响、研究环境中微生物的降解能力等。除了16S扩增子测序和宏基因组测序外，还有其他的微生物检测方法，如荧光原位杂交、定量PCR等。这些方法各有优缺点，应根据研究目的和预算选择合适的方法。

总之，微生物的检测和研究对于生态系统和人类健康都非常重要。16S扩增子测序和宏基因组测序是两种常用的微生物检测方法，它们可以用于研究微生物的多样性和功能。在选择检测方法时，应根据研究目的和预算选择合适的方法。