CGT药物检测:解读mRNA分子优势
2023-08-30
中科新生命
1455
细胞与基因治疗（CGT）药物通过直接将外源基因或基因编辑工具导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正、增加或敲除特定基因以发挥治疗作用，直接作用于遗传物质，能有效针对无法找到成药靶点的疾病，可实现“一次性给药、永久性治疗”的治疗效果，目前已在遗传病和恶性肿瘤领域取得重大成果，并为广大慢性病及传染病患者带来希望。
作为CGT领域的明星赛道，以mRNA分子作为治疗性药物逐步走向临床，并展现了许多传统大分子所没有的独特优势。
mRNA是一种单链核糖核酸，携带蛋白质合成所需的遗传信息，在细胞质种利用核苷酸进行转录表达，翻译加工生成机体所需的功能蛋白。临床上主要包含传统非复制型mRNA疫苗和可自复制的mRNA疫苗，传统非复制型mRNA由5’-cap、5’-UTR、ORF、3’-UTR 、3’-polyA组成，自复制mRNA产品在上述基础上增加复制子，可以实现mRNA在细胞内的扩增（图1）。
图1. 两种主要的mRNA疫苗
mRNA药物可利用细胞内的遗传物质编码功能蛋白，从而实现免疫或治愈疾病的功能。目前，mRNA药物的体外转录技术和工艺制备流程逐渐成熟，工艺路线包含质粒制备、质粒线性化、mRNA 体外转录、纯化、mRNA-载体制备、mRNA-载体纯化、制剂（图2）。
图2. mRNA制剂工艺流程
为保障药物的安全性和有效性，mRNA药物的设计和工艺必须保证其核酸序列的准确性、保证核酸序列不会编码错误蛋白或在人体非靶细胞内发挥活性功能，从而引起不可逆的副作用；同时需具备严格的工艺开发和可控的工艺步骤，全面了解工艺引入的杂质。
根据USP Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality第二版，对mRNA药物，包含重要原材料质粒（表1）、mRNA DS（表2）、制剂终产品（表3）须要有全面深入的药学分析和表征。
表1
质粒检测
|
质量 |
检项 |
方法 |
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确认 |
测序 |
测序 |
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限制性酶切图谱 |
限制性酶切+核酸凝胶电泳 |
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浓度 |
A260 |
UV |
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纯度 |
A260/A280 |
UV |
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超螺旋含量 |
CE或HPLC |
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残留RNA |
HPLC或核酸凝胶电泳 |
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残留DNA |
qPCR |
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残留蛋白 |
SDS-PAGE或BCA |
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残留宿主蛋白 |
ELISA |
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卡那残留 |
ELISA |
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安全性 |
无菌检测 |
USP<71>；中国药典2020 <1101> |
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内毒素 |
USP<85>；中国药典2020 <1143> |
|
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理化 |
外观 |
USP<1>；USP<790> |
|
pH |
USP<791>；中国药典2020 <0631> |
表2
mRNA DS检测
|
质量 |
检项 |
方法 |
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确认 |
测序 |
一代测序/二代测序/RT-PCR |
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含量 |
RNA浓度 |
qPCR/ddPCR/UV |
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完整性 |
完整性 |
CE/CGE/核酸凝胶电泳 |
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纯度 |
5’-Cap |
RP-LC-MS/MS; IP-RP-HPLC |
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3’-polyA |
IP-RP-HPLC |
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dsRNA |
Immunoblot; ELISA |
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聚集体 |
SEC-HPLC |
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mRNA片段 |
RP-HPLC |
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残留DNA模板 |
qPCR |
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残留游离核酸 |
RP-LC-MS/MS |
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残留核酸酶 |
ELISA |
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活性 |
蛋白表达 |
Cell-based assay |
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安全性 |
无菌检测 |
USP<71>；中国药典2020 <1101> |
|
内毒素 |
USP<85>；中国药典2020 <1143> |
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|
理化 |
外观 |
USP<1>；USP<790> |
|
pH |
USP<791>；中国药典2020 <0631> |
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|
溶剂残留 |
USP<467>；中国药典2020 <0861> |
表3
制剂检测
|
质量 |
检项 |
方法 |
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确认 |
测序 |
一代测序/ RT-PCR |
|
脂质体确认 |
RP-HPLC-CAD |
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含量 |
包封率 |
RiboGreen RNA |
|
脂质体含量 |
RP-HPLC-CAD |
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完整性 |
LNP粒径与分散性 |
DLS |
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RNA分子大小与完整性 |
CGE |
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纯度 |
聚集体 |
SEC-HPLC |
|
mRNA片段 |
IP-RP-HPLC |
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|
活性 |
蛋白表达 |
Cell-based assay |
|
安全性 |
无菌检测 |
USP<71>；中国药典2020 <1101> |
|
内毒素 |
USP<85>；中国药典2020 <1143> |
|
|
理化 |
外观 |
USP<1>；USP<790> |
|
pH |
USP<791>；中国药典2020 <0631> |
|
|
溶剂残留 |
USP<467>；中国药典2020 <0861> |
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渗透压 |
USP<785>；中国药典2020 <0632> |
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可见异物 |
USP<787>；中国药典2020 <0904> |
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装量 |
USP<698>；中国药典2020 <0942> |
中科新生命
生物医药CMC药学质量研究领导者
