项目文章Blood（IF 20.3）|中科院上海营养与健康研究所利用TMT标记蛋白组学助力白血病机制研究
2023-08-08
中科新生命
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急性髓细胞白血病(AML)是一种遗传异质性的恶性血液病，存活率很低。在过去的几年里，许多AML细胞内潜在的遗传和表观遗传损伤的发现为临床进步带来了希望。然而，除了细胞自主功能外，非细胞自主机制也是AML的重要原因。骨髓微环境(bone marrow microenvironment, BMM)通过分泌因子调控白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)。越来越多的研究表明，通过了解BMM维持LSC的机制可能为AML提供潜在的治疗策略。ID1作为LSC中一个关键的转录调节因子,在AML-BMM中的作用机制有待探究。
2023年6月，中科院上海营养与健康研究所王兰研究院团队在期刊Blood (IF 20.3)上发表了题为“The cell non-autonomous function of ID1 promotes AML progression via ANGPTL7 from the microenvironment”的文章。该研究团队利用TMT标记蛋白组学技术结合qPCR和Western blot分析，发现ID1在AML-BMM中的关键作用，并有助于AML治疗策略的制定。中科新生命为该研究提供了TMT标记蛋白质组学技术服务。
研究材料
人骨髓基质细胞系HS-5， 小鼠骨髓基质细胞系MS-5， 健康人的BMSC，AML患者的BMSC， AML小鼠骨髓间充质干细胞， AML小鼠骨髓液
技术路线
步骤1：ID1在AML亚型M2和M5中高度表达；
步骤2：BMSCs中的ID1促进AML细胞增殖；
步骤3：ANGPTL7促进AML细胞体外扩增；
步骤4：ID1介导的SP1蛋白水平对ANGPTL7转录的作用；
步骤5：ID1和RNF4之间的相互作用抑制SP1泛素化；
步骤6：骨髓内注射Angptl7显著促进Id1缺陷受体的AML进展。
研究结果
1. ID1在AML亚型M2和M5中高度表达
为了确定Id1在BMM中的作用，研究团队通过qPCR和Western blot检测分析Id1在HSC和不同类型的BMM细胞中的表达模式。结果显示Id1在HSC和几种BMM细胞中均有表达，Id1在MSCs的mRNA和蛋白水平高于其他组(图1A-B)。由于Id1在BMM细胞中高度表达，因此进一步确定Id1是否通过非细胞自主作用调节白血病。qPCR和Western blot分析HD-MSCs和AML-MSCs，检测结果显示AML-MSCs的ID1 mRNA和蛋白水平高于HD-MSCs(图1C-E)。为了了解是否所有AML亚型的MSCs中ID1水平都增加了，接下来将HS-5细胞与不同基因组成的白血病细胞进行共培养试验 (图1F)。4天后，从共培养系统中收集HS-5细胞，并进行qPCR和蛋白质印迹分析。与CD34+ 细胞相比，观察到与M2亚型AML细胞(Kasumi-1、HL-60、SKNO-1)和M5亚型AML细胞(THP-1、MOLM-13、MV4-11、NOMO-1)一起培养的HS-5细胞中ID1表达水平显著升高(图1G-H)。为了进一步验证ID1在这两种AML-BMM亚型中的作用，进行了体内二次移植试验。将2×104个AML1-ETO9a (AE9a)或MLL-AF9的白血病细胞移植到亚致死剂量照射的受体体内(图1P)。移植两周后，使用qPCR和Western blot分析AML小鼠和对照小鼠的BMM细胞。结果显示Id1在AML-BMM的mRNA和蛋白水平较高，特别是在MSCs中表达水平最高(图1Q-S)。综上所述， ID1在AML1-ETO/MLL-AF9诱导AML中潜在的非细胞自主作用。
图1 ID1在AML-MSCs中高度表达
2.BMSCs中的ID1促进AML细胞增殖
BMSC细胞系HS-5，MS-5和OP9是用于体外促进HSPC扩增或分化的关键基质细胞系。使用体外共培养系统的模型进一步研究了ID1在AML中的非细胞自主作用。用sgRNA和shRNA靶向ID1，发现HS-5、MS-5和OP9细胞中ID1在蛋白水平上显著表达(图2A)。将Kasumi-1、SKNO-1、THP-1和MOLM-13细胞与HS-5细胞共培养了4天(图2B)，MTT检测结果表明，HS-5细胞中ID1的缺失显著抑制了AML细胞的非细胞自主增殖(图2C-F)。接下来作者试图评估Id1在亚致死剂量照射受体小鼠AML进展中的非细胞自主作用(图2L)。AE9a (n=9)或MLL-AF9 (n=10)细胞系的Id1-/-小鼠比Id1+/+组具有更长的寿命(图2M)。因为这些细胞是荧光素酶阳性的，在移植后，与Id1-/-受体相比，在Id1+/+小鼠中检测到更强的生物发光信号(图2N)。总之，BMSCs中的Id1敲除主要抑制AML细胞系的生长，并诱导这些细胞中的细胞周期停滞。
图2 BMSCs细胞中ID1基因敲除抑制体内外AML细胞增殖
3. ANGPTL7促进AML细胞体外扩增
为研究AML患者Id1+/+和Id1-/-在髓上清液(BMSF)中的蛋白质变化，基于TMT标记白质组学(图3A)。在每个样品中定量了6973种蛋白质，其中鉴定到371种差异表达的蛋白质。热图显示BMSF蛋白质组中前20种下调和上调的分泌蛋白(图3B)。对于Id1-/- BMSF中的下调因子，使用qPCR验证了这些蛋白在AML患者中的表达，AML-BMSCs中Angptl7 mRNA水平上调(图3C)。进一步用ELISA、Western blot和qPCR检测来评估AML患者骨髓液和MSCs中ANGPTL7的水平，发现与健康个体相比，AML样本中ANGPTL7水平显著增加(图3D-E)。
图3 Id1增强BM细胞释放Angptl7，促进AML进展
4. ID1介导的SP1蛋白水平对ANGPTL7转录的作用
SP1是一种高度表达的转录因子，作者发现在与Kasumi-1细胞共培养的HS-5细胞中，ID1的缺失降低了SP1的蛋白水平，但没有降低其mRNA水平。 与之相反，ID1过表达增加了SP1蛋白水平，但没有增加mRNA水平(图4A-C)。敲除与THP-1细胞共培养的HS-5细胞中ID1降低了SP1的蛋白水平。ID1的过表达增加了SP1蛋白水平，不是mRNA水平(图4D-F)。总之，敲除与AML细胞共培养的HS-5细胞中的ID1，显著降低SP1蛋白水平，随后抑制ANGPTL7转录。
图4 ID1介导的SP1蛋白水平对Angptl7转录
5. ID1和RNF4之间的相互作用抑制SP1泛素化
为了研究阴性DNA结合因子ID1是如何调节SP1蛋白水平的，作者使用质谱进行ID1相互作用组分析。使用抗HA抗体免疫沉淀与表达MLL-AF9的白血病细胞共培养4天的MS-5细胞的全细胞裂解物，硝酸银染色分析显示HA-Id1被免疫沉淀。鉴定到与HA-Id1相互作用的Sp的泛素E3连接酶Rnf4(图5A)。将pCMV-RNF4-FLAG质粒转染到表达HA-ID1的HS-5细胞和对照细胞，和免疫共沉淀试验证实HA-ID1和RNF4之间的相互作用(图5B-C)。随后进行GST下拉分析，显示出ID1和RNF4之间的直接相互作用(图5 D)。随后，在RNF4的shRNA或对照shRNA转导的HS-5细胞中，分别使用qPCR和蛋白质印迹分析检测RNF4和SP1的表达。RNF4显著下调，SP1蛋白上调但不影响ID1蛋白(图5E)。为确定ID1-RNF4相互作用是否影响SP1蛋白，进行GST下拉分析，并检测到在HA-ID1存在下GST-RNF4结合SP1的量显著减少(图5F)。
图5 ID1和RNF4之间的相互作用抑制SP1泛素化
6. 骨髓内注射Angptl7显著促进Id1缺陷受体的AML进展
为了更好地证实ID1调节AML-BMM中的ANGPTL7以维持LSC并影响体内AML进展，研究团队进行Angptl7股内注射。在治疗后，Angptl7治疗的Id1-/-白血病小鼠的存活率在AE9a和MLL-AF9衍生的白血病中显著缩短(图6A-B)。BM流式细胞仪分析显示，未经Angptl7处理的Id1-/-受体的脾和PB细胞含有较少百分比的GFP+c-Kit+白血病原始细胞，并显著降低了MLL-AF9驱动的白血病中L-GMP细胞的百分比(图6C-H)。总之，数据表明Id1调节Angptl7促进白血病的发展。
图6 骨髓内注射Angptl7显著促进Id1缺陷受体的AML进展
文章小结
AML的临床治疗在过去几年中有了显著改善，但依然存在着重大挑战，如高分子多样性和AML的复杂性、疾病的演变和病程治疗。研究团队利用TMT标记蛋白组学技术结合qPCR和Western blot分析，发现ID1直接与RNF4相互作用，减弱SP1泛素化，并促进AML-MSCs中ANGPTL7的表达。更重要的是，ID1作为MSCs中调控白血病细胞非细胞自主性的关键转录调节因子，控制白血病的启动和进展，表明ID1作为AML治疗靶点的重要性，并有助于AML治疗策略的发展。
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