血液4D-DIA蛋白组项目文章NC（IF 17.69）| 西南医院柴进教授团队采用血液蛋白质组学等方
2023-05-30
中科新生命
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原发性胆管炎(PBC)是一种慢性自身免疫性肝病,全世界每年有超过10万例PBC新确诊病例。病理上显示PBC最初破坏肝内小胆管中的胆道上皮细胞(BECs)，临床上表现为出现抗线粒体抗体(AMA)。之前的研究表明进行性体液和细胞免疫反应可破坏BECs，但是自身免疫反应破坏PBC患者肝脏中的小BECs的机制，及在PBC发病的早期阶段BECs的靶点目前尚不清楚。此外，之前的研究发现聚合免疫球蛋白受体（pIgR）可引起BEC的凋亡和胆道损伤，但是pIgR是否或如何参与PBC的发展和进展，尤其是在PBC发病的早期阶段也不清楚。
2023年2月9日，第三军医大学第一附属医院(西南医院)消化内科兼胆汁淤积性肝病中心柴进教授团队在Nature Communications（IF 17.694）发表了题目为“Unique DUOX2+ACE2+small cholangiocytes are pathogenic targets for primary biliary cholangitis”的研究成果，该研究利用单细胞RNA测序、流式分选(FACS)等方法，在人和小鼠肝脏中鉴定了一种独特类型的DUOX2+ACE2+小胆管细胞。作者还通过血液蛋白质组学、qRCR等方法发现pIgR在DUOX2+ACE2+胆管细胞中高度表达。研究证实高表达pIgR抗原的DUOX2+ACE2+小胆管细胞是PBC的致病靶点。中科新生命为该研究提供血液4D-DIA蛋白质组学技术服务。
研究材料
对照组和PBC患者肝脏样本和血清样本、小鼠肝脏样本
技术路线
步骤1：PBC肝脏单细胞转录组图谱；
步骤2：独特DUOX2+ACE2+小胆管细胞的发现；
步骤3：DUOX2+ACE2+小胆管细胞在PBC中的功能及临床意义研究；
步骤4：寻找与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关的免疫细胞；
步骤5：寻找与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关的免疫细胞中关键蛋白。
研究内容
1. PBC肝脏单细胞转录组图谱
作者对4名对照组受试者（CTR）和5名PBC患者的肝脏进行了单细胞转录组测序分析（图1a），质控后共获得70,050个肝细胞。UMAP（统一流形逼近与投影）分析显示共鉴定到30个细胞群(图1b)，分为11种细胞类型(图1d)。细胞类型差异分析发现与对照组相比，PBC肝脏中内皮细胞、胆管细胞和间充质细胞的比例减少，而T细胞和浆细胞的比例增加（图1g-1h）。
图1 肝细胞的单细胞转录组图谱
2. 在人类和小鼠肝脏中发现独特的DUOX2+ACE2+小胆管细胞
由于PBC的特点是选择性破坏小BECs，作者进一步分析了胆管细胞。结果发现胆管细胞共分为8个簇(图2a-2b)，其中胆管细胞簇（3）仅在对照组中被检测到，而未在PBC肝脏中检测到（图2c-2d）。此外，胆管细胞簇（3）的双氧化酶2 (DUOX2)和血管紧张素转换酶2 (ACE2)呈现高表达的状态（在其他胆管细胞簇中表达非常低）（图2e-2f），这表明人类肝脏中有一个独特的胆管细胞亚群是PBC的潜在靶点。接下来，作者通过流式细胞分选、RNAscope、qPCR等方法证实肝细胞高表达CK19、DUOX2和ACE2，且高表达胆管细胞特异性标记物、高表达小胆管细胞的标记基因（图2g-2j），故作者将胆管细胞簇（3）定义为DUOX2+ACE2+胆管细胞。
图2 DUOX2+ACE2+小胆管细胞的鉴定
3. DUOX2+ACE2+小胆管细胞在PBC中的功能及临床意义研究
KEGG通路分析发现与其他胆管细胞簇相比，DUOX2+ACE2+小胆管细胞中胆汁分泌通路显著富集(图3a)。且肝脏切片RNAscope和多重IF分析显示，与对照组相比，PBC患者小胆管中DUOX2+ACE2+小胆管细胞的数量显著减少(图3b-e)。此外，DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量的减少与PBC的严重程度显著相关（图3f）。另外，在AMA-M2阳性或AMA-M2阴性的PBC患者中，肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量显著减少，但在阻塞性胆汁淤积症(OC)、继发性硬化性胆管炎(SSC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中则没有(图3g)。综上所述，PBC中肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量显著减少与胆汁分泌障碍和PBC严重程度密切相关。
图3 DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量的减少与胆汁分泌障碍和PBC严重程度显著相关
4. CD27+记忆B细胞和浆细胞聚集在PBC患者的肝门静脉区，并与DUOX2+ACE2+小胆管细胞相互作用
众所周知，PBC是由自身免疫介导的胆道损伤引起的。为了研究哪些免疫细胞浸润与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关，作者使用苏木精-伊红(HE)(图4a)、空间转录组学(ST)(图4b-e)和多重IF分析(图4f)对照组和PBC患者的冷冻肝脏切片进行分析。结果发现与对照组相比，PBC肝切片中B细胞、浆细胞和T细胞比例增加（图4c），PBC肝门静脉区位置B细胞和浆细胞浸润明显增加、单核细胞和NK细胞比例明显降低(图4d-4e)、DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量显著减少而B细胞和浆细胞数量显著增加（图4f）、CD27+记忆B细胞数量显著增加（图4f）。此外，与对照组相比，PBC患者的浆细胞克隆扩增增加(图4g)。接下来，作者使用CellPhoneDB分析了DUOX2+ACE2+小胆管细胞与免疫细胞之间的潜在相互作用。结果显示配体与DUOX2+ACE2+小胆管细胞和免疫细胞表达的受体之间存在显著的相互作用(图5a-c)。综上所述，PBC发病过程中，免疫应答与肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞数量的选择性减少有关，也可能通过细胞-细胞相互作用影响其他类型的胆管细胞。
图4 CD27+记忆B和浆细胞在PBC患者肝门静脉区聚集
图5 DUOX2+ACE2+小胆管细胞与免疫细胞的相互作用
5. PBC患者肝脏pIgR在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中高表达，血清抗pIgR抗体水平明显升高
为了研究浆细胞产生的自身抗体与肝脏DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤的关系，作者对对照组和PBC患者的血清样本进行4D-DIA蛋白质组学分析（未去除血清高丰度蛋白） (图6a-6b)。血清蛋白质组学共定量到2805个蛋白，其中50个蛋白显著上调、87个蛋白显著下调（PBS/TCR）(图6c)。显著差异分析和火山图结果显示PBC患者血清pIgR水平明显高于对照组（图6d-6e）, PBC患者血清抗pIgR抗体水平也显著升高(图6f)。对人类和/或小鼠肝细胞的进一步分析显示，在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中，pIgR mRNA转录物和蛋白质的水平明显高于DUOX2-ACE2-胆管细胞和其他类型的肝细胞(图6h-j)。另外，在对照组肝脏中，pIgR蛋白主要在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中检测到，而在PBC肝脏中，pIgR蛋白的表达明显降低 (图6k)。综上所述，在人类PBC的致病过程中，pIgR特异性自身抗体可能与DUOX2+ACE2+小胆管细胞损伤有关。
图6 pIgR主要在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中表达，PBC患者血清中pIgR及其抗体水平明显升高
小结
该研究通过结合单细胞转录测序、多重免疫荧光(IF)等的方法鉴定出肝脏中独特的DUOX2+ACE2+小胆管细胞，并验证了其减少与PBC疾病严重程度的相关性。此外通过血清蛋白质组学（4D-DIA）等方法证实了pIgR在DUOX2+ACE2+小胆管细胞中的高表达。该结果为PBC的早期致病过程提供了新的见解，并为PBC的诊断和治疗干预提供了特定的生物标志物。
