CRISPR-Cas9技术：sgRNA合成与转染实现精准基因修饰
2023-05-29
中科新生命
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CRISPR-Cas9技术
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列，引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割，形成DNA双链断裂，通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等，达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。
△图1.CRISPR/Cas9系统的组成部分【1】
sgRNA简介
什么是gRNA？
gRNA （或称向导 RNA）是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分：一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对，引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。
什么是SgRNA？
sgRNA 代表单向导 RNA【2】。将crRNA和tracrRNA改造成单个长 RNA，长度通常为 100 nt仍然具有双链DNA的剪切功能【3】（图2）。可以从载体表达或化学合成。
△图2.sgRNA的组成
为什么选择sgRNA而不是crRNA : tracrRNA？
• 操作便捷：无需退火操作使crRNA和tracrRNA结合
• 更稳定：与Cas9蛋白结合更牢固
• 编辑效率更高：提高实验效率与成功率，原代细胞、干细胞优选
sgRNA合成
化学合成sgRNA一般是指通过特殊算法设计，利用高通量化学合成平台，高效合成序列100%正确，且具有功能性蛋白敲除能力的sgRNA。同时，在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰，可以提高sgRNA稳定性，并降低脱靶效应【4】。
sgRNA转染方式
在CRISPR-Cas9系统中，利用Cas9和化学合成sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）替代传统的质粒、慢病毒转染模式，具有简单快捷、脱靶效应低、编辑效率高、转染效率高，无细胞毒性，无DNA干扰等优势，逐渐成为基因编辑基础科研实验的绝佳选择。如图3所示：
△图3.RNP转染
【1】 Song G, Jia M, Chen K, et al. ScienceDirect CRISPR / Cas 9: A powerful tool for crop genome editing. The Crop Journal. 2016.
【2】Jinek, M.; East,A.; Cheng, A.; Lin, S.; Ma, E.; Doudna, J. RNA-programmed genomeediting in human cells. eLife. 2013. 2,e00471. doi:10.7554/elife.00471
【3】Jinek, M.;Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier,E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in AdaptiveBacterial Immunity. Science. 2012. 337(6096),816–821. doi:10.1126/science.1225829
【4】Hendel, A.; Bak,R. O.; Clark, J. T.; Kennedy, A. B.; Ryan, D. E.; Roy, S.; Steinfeld,I.; Lunstad, B.D.; Kaiser, R.J.; Wilkens, A. B.; Bacchetta, R.;Tsalenko, A.; Dellinger, D.; Bruhn, L.; Porteus, M. H. Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in humanprimary cells. Nature Biotechnology. 2015. 33(9),985–989. doi:10.1038/nbt.3290
