环境微生物定量研究工具QIIME简介-微生物多样性检测应用示例
2023-05-29
中科新生命
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QIIME简介
微生物多样性检测是利用高通量测序技术，通过检查环境微生物（主要是细菌）特定可变区的丰度，以此鉴定生物标本微生物群落的分类及丰度的一项技术。QIIME 是 Quantitative Insights Into Microbial Ecology 的简称，读音 chime，直译过来就是环境微生物定量研究工具。2010年，美国科罗拉多大学的Rob Knight教授（现单位美国加州大学圣地亚哥分校）团队发布QIIME分析流程。自QIIME分析流程发布以来引用超过2万次，逐渐成为微生物研究领域一个著名的工具。
图1 QIIME软件入选《Nature》评出的人体微生物组研究25大里程碑事件
为了满足日益增长的测序数据量和可重复计算的要求，2016年，Rob Knight实验室和Greg Caporaso实验室（QIIME文章的第一作者，现在拥有独立实验室）共同开发的一款跨时代革命性的全新扩增子微生物组分析流程——QIIME2。全新的QIIME2是一个可复制的、可扩展的和去中心化的微生物组分析平台，侧重于数据分析的透明度。QIIME2使研究人员能够从原始DNA序列数据开始分析，并获得满足期刊质量的图片和统计结果。
图2 QIIME2官网介绍界面
图3 QIIME2发布：可复制、交互式、可扩展以及去中心化的微生物分析工具
中科新生命《微生物多样性v2.0》全新起航，全流程QIIME2分析，内容包括 ASVs分析及物种注释、α-多样性、β-多样性、物种差异与标志物种分析、组间群落结构差异显著性检验、环境因子关联分析以及功能预测等，助力微生物多样性数据分析。技术路线如下：
图4 中科新生命微生物多样性v2.0生信分析流程图（左：16S/18S；右：ITS）
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QIIME2作为代表未来的分析方法标准，在上线后引用量一直飙升，根据Dimensions数据库显示，QIIME2文献的引用量以超过2700余次，而且呈现逐年递升的趋势。其中不乏单一的微生物多样性文章。
图5 QIIME2文献的引用量
QIIME2流程目前涉及的研究领域非常广泛，下面给大家分享一波经典案例，带各位老师一起学习QIIME2流程在数据处理方面的优势之处。
微生物代谢产物对甲酚通过重塑肠道微生物群诱导产生小鼠自闭症样行为
自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorders，ASD）由遗传易感性和环境风险之间的相互作用引起。越来越多的证据支持肠道微生物群-脑轴参与ASD。在ASD的啮齿类动物模型中也观察到微生物群组成的改变和微生物代谢产物水平的异常。在与ASD相关的微生物代谢产物中，对甲酚尿水平与ASD行为改变的严重程度相关。到目前为止，微生物群失调、对甲酚产生和ASD症状之间的因果关系尚未得到证实。
2022年9月，蔚蓝海岸大学分子和细胞药理学研究所国家科学研究中心Dumas等人在Microbiome（IF 16.837）杂志上发表题为“The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota”的研究文章。之前研究表明在与ASD相关的微生物代谢物中，ASD患者的尿液和粪便中始终发现小芳香代谢物对甲酚及其衍生物水平升高。文章通过16S核糖体RNA测序分析对甲酚处理和对照小鼠的粪便微生物群的细菌组成，利用LC-MS等定量分析小鼠粪便中对甲酚的水平，通过粪便微生物菌群移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）研究肠道微生物菌群对甲酚诱导的小鼠社会行为缺陷的影响。其潜在的机制可能是对甲酚可以在肠道内局部作用改变肠道微生物菌群，从而胁迫肠道免疫和神经内分泌细胞、肠道神经元或迷走神经传入，从而扰乱微生物-肠道-大脑轴并诱导小鼠自闭症类似行为的产生。
实验材料：对照小鼠（n=15）和对甲酚处理小鼠（n=14），FMT小鼠（n=15）FMT对照小鼠（n=15）；血液和粪便样本。
技术方法：16S rDNA测序
技术路线：
使用对甲酚处理小鼠；
测定小鼠行为实验以及VTA多巴胺神经元的兴奋性；
收集对照和对甲酚处理小鼠粪便进行16s测定；
对甲酚处理小鼠肠道菌群移植到未受处理小鼠，并测定行为实验；
收集对甲酚处理小鼠肠道菌群移植到未受处理小鼠粪便进行16s测定；
正常小鼠肠道微生物菌群移植对甲酚处理小鼠，并测定行为实验以及VTA多巴胺神经元的兴奋性。
实验结果：
1. 暴露于对甲酚的小鼠表现出ASD样行为，这种行为在处理中断后持续存在
研究者模拟胃肠道暴露于对甲酚，从4.5周龄开始在饮用水中用对甲酚处理C57BL/6J雄性小鼠，对对甲酚处理的小鼠进行了行为表型分析。与对照小鼠相比，对甲酚处理小鼠表现出社交能力降低，刻板行为的增加。在二元社会互动和刻板印象直接监测中记录的得分的主成分分析中，对甲酚处理的小鼠沿PC1轴与对照小鼠明显分离。
在4周冲洗后，对甲酚对社交互动和刻板/持久行为的影响持续存在，并且具有类似的程度。社会行为和刻板印象评分的主成分分析显示，对照组和对甲酚处理的小鼠在冲洗前和冲洗后沿PC1轴明显分离。这些结果表明，对甲酚选择性诱导ASD核心症状，这些症状在对甲酚暴露后持续存在。
图1 对甲酚处理诱导自闭症样行为
2. 对甲酚损害腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元的兴奋性
研究者研究了对甲酚暴露对外侧VTA中多巴胺神经元电生理财产的影响。使用全细胞膜片钳记录对照和对甲酚处理小鼠急性脑切片中的VTA多巴胺神经元。对甲酚处理的小鼠表现出VTA多巴胺神经元的兴奋性降低，诱发动作电位的数量减少。与对照组相比，对甲酚处理动物的VTA多巴胺神经元中的小型自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的振幅和频率均降低。
图2 对甲酚处理改变VTA多巴胺神经元的兴奋性
3. 对甲酚对肠道微生物生态的影响
研究者使用16S核糖体RNA（rRNA）测序分析了对甲酚处理和对照小鼠粪便微生物群的细菌组成。通过sob指数、Shannon指数和Pielou指数评估，两组之间的细菌丰富度或均匀度没有差异。相比之下，基于Aitchison距离的β-多样性分析显示，对甲酚处理的小鼠和对照小鼠之间的微生物组成存在显著差异。使用ANCOM分析，发现分属于Bacteroidales, Clostridiales 和 Burkholderiales目的19个ASV、4个种2个属具有判别性（|centered-log ratio (CLR)| > 0.2; W = 0.7）。同时在对甲酚处理的小鼠中发现15个分类特征上升（10个ASV，3种，2属）。特别是，对甲酚处理增加了Duncaniella dubosii、Barnesiella sp.、Muribaculaceae、Anaerobium sp.和Turicimonas muris的ASV计数。另外，还发现了10个分类特征（9个ASV，1个物种），均隶属于梭菌目，在对甲酚处理的小鼠中缺失。以及，在对甲酚处理的小鼠中隶属于Eisenbergiella sp., Lacrimispora saccharolytica, Clostridiaceae bacterium, Ruthenibacterium lactatiformans, Anaerobium sp.的ASV计数呈减少趋势。
研究者使用了随机森林分析，分别发现13个ASV和15个ASV是促进社会能力和刻板印象变化的最强驱动力。值得注意的是，对于社会行为得分中，高达12%的得分由所属于Duncaniella dubosii的一种ASV解释。
图3 对甲酚影响微生物组成
4. 对甲酚处理小鼠的微生物群在移植给未经处理的受体时会导致社会行为缺陷
为了研究微生物群组成的变化是否可以解释对甲酚诱导的行为改变，研究者将对甲酚处理或对照小鼠的粪便微生物群移植到未经处理的受体，并在FMT后3周评估其行为。与FMT对照小鼠相比，FMTp Cresol小鼠的社交能力降低、表现社交缺陷。在社交互动和刻板印象得分的主成分分析中，FMT对照组和FMTp Cresol组沿着PC1轴分离。总之，将对甲酚处理小鼠的微生物群移植到未经处理的受试者身上，概括了对甲酚处理对社会行为缺陷和部分刻板印象的影响。
图4 对甲酚处理后微生物群重塑导致社会行为缺陷
5. 将对甲酚处理过的小鼠的微生物群移植给未经处理的受体会影响肠道微生物生态
研究者使用16S rRNA测序来分析FMT对照和FMTp Cresol小鼠在FMT后3周的微生物群。两组之间的微生物丰富度和均匀度相似，基于Aitchison距离的β-多样性分析显示，FMT对照和FMTp-甲酚小鼠之间的微生物组成存在显著差异。ANCOM分析显示，22种ASV、5种、3属和1科具有判别性（|CLR |>0.2；W=0.7）。在FMTp Cresol小鼠中，与Duncaniella dubosii、Barnesiella sp.和Anaerobium sp.相关的ASV计数增加。在FMTp Cresol小鼠中，与 Eisenbergiella sp., Lacrimispora saccharolytica, 和 Clostridiaceae 相关的ASV计数减少。
此外，FMTp-甲酚小鼠的粪便中对甲酚含量增加，表明与FMT对照小鼠相比，这些小鼠的微生物群产生了更多的对甲酚。研究者在对Cresol处理的小鼠和FMTp Cresol中表现出丰度增加的细菌分类群（Duncaniella dubosii、Barnesiella spp.和Anaerobium spp.）中寻找与TyrB、ThiH和HpdA/B/C具有至少30%同源性的蛋白。为了确定pCresol产生的细菌种类，我们使用RF分析来确定ASV计数，并鉴定得到几种与Clostridioides spp和Anaerostipes有关的ASV。
图5 对甲酚诱导的微生物群的移植会影响微生物组成，增加对甲酚的产生
6. 将正常微生物群移植给对甲酚治疗的受体可恢复社会行为、VTA多巴胺神经元兴奋性和粪便对甲酚
在FMTp-Cresol小鼠表现出社会行为缺陷后，研究者研究了对甲酚诱导的行为改变是否可以通过FMTControl恢复。对甲酚处理小鼠的FMTControl在测试中表现出社交指数、对互动鼠标的偏好和社交互动的质量也得到了提升。通过对FMTControl前后的对照小鼠进行PCA分析，证实了FMTControl行为的正常化。最后，对甲酚处理小鼠的FMT控制恢复了VTA多巴胺神经元的兴奋性。
图6 将微生物群从对照小鼠移植到对甲酚治疗的小鼠可恢复社会行为缺陷、VTA多巴胺神经元兴奋性和粪便对甲酚水平
结论：
本研究利用16s测序以及粪菌移植技术分析了对甲酚诱发小鼠自闭类似行为以及小鼠肠道菌群的影响。研究结果清楚地表明，对甲酚可以诱导小鼠产生ASD的社交缺陷和重复刻板行为，即使停止处理症状仍持续存在，同时小鼠的VTA多巴胺神经元活性降低，肠道菌群结构和特定分类但愿发生改变。移植对甲酚处理小鼠粪菌会诱发ASD典型行为，且改变肠道菌群增加对甲酚的生成；移植正常小鼠粪菌，可使对甲酚处理小鼠回复社会行为，VTA多巴胺神经元活性以及粪便对甲酚行为。
QIIME2流程在其他研究领域的应用
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全新的QIIME2是一个强大的、可扩展的和去中心化的微生物组分析平台，侧重于数据分析的透明度。QIIME2使研究人员能够从原始DNA序列数据开始分析，并获得满足期刊质量的图片和统计结果。QIIME2保留了QIIME1强大和广泛使用等优点，也改进了先前版本中的不足。
全新的QIIME2平台具有以下几大优点：
安装更加简单，支持多种系统，能够满足绝大多数使用者的需求；
分析流程化，更加标准化，不让用户盲然下面该做什么；
分析可重复性强，全新定义了文件系统，即包括分析数据、也包括分析过程和结果，每一步的结果，均可追溯全部分析过程，方便检查和重复；
修正测序错误，注释更为精准，QIIM2使用DADA 2降噪的方法获得扩增序列变体（ASVs），DADA2可以修正扩增子的测序错误，确定更多的真实变异，且它不再以相似度聚类，只进行去重或者说相当于以100%相似度聚类，相比于传统的以97%相似性聚类获得的物种注释信息会更准确；
不同批次数据可直接合并分析，QIIME2以100%相似度聚类，合并分析无需重新聚类，直接合并特征序列丰度表即可进行后续的标准分析工作；
支持多种用户界面（如API、命令行、图形界面）；
是一个开源的平台，每一个使用者均可开发插件；
可视化功能强大，在使用时可生成交互式图形以便使用者了解数据处理结果；
具有相对完善的社区平台，多人多地结果图表方便共享，适合当下科研合作的需求。
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