Cancer Cell | 不容错过的糖代谢高分文章！李贵登团队揭示甘露糖增强T细胞干性，增强抗肿瘤能力

黑色素瘤小鼠模型、小鼠来源的原代T细胞、多种肿瘤细胞系

转录组、单细胞转录组、非靶代谢组、代谢流、CUT&Tag-seq等

利用已经公开发表的人类癌症的肿瘤浸润 T 细胞 (TIL) 和小鼠肿瘤、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 慢性感染的耗尽 T 细胞的scRNA-seq 数据集分析 TIL 的异质代谢景观，观察到了与耗竭相关的代谢途径的高度富集，其中就包括果糖/甘露糖代谢。随后构建甘露糖磷酸异构酶 (Mpi) 缺失的小鼠模型，发现缺失Mpi会促进耗竭亚群的产生并抑制T细胞中细胞因子的产生，表明Mpi缺失导致的甘露糖代谢紊乱会促进T细胞耗竭。

对接受过继T细胞疗法（ACT）的B16-OVA 小鼠口服 D-甘露糖，发现补充D-甘露糖改善了肿瘤控制，并增加了肿瘤内OT-I T细胞的百分比和数量，这些 T 细胞表现出较高的TCF1表达和较低的CD39 表达，并且 IFN-γ⁺和 TCF1⁺IM-3^-Tpex细胞的频率增加。这表明补充D-甘露糖可限制T细胞的耗竭分化并增强体内抗肿瘤免疫。进一步地，对这些OT-I TIL进行单细胞转录联合表面蛋白测序 (CITE-seq)，发现口服甘露糖处理组中表达干性与增殖相关基因/蛋白的cluster占比更高，且甘露糖代谢、核苷酸代谢、氧化磷酸化和胆固醇生物合成等代谢途径也被激活。而未口服甘露糖组中则是以表达耗竭相关基因的cluster为主。因此，通过口服D-甘露糖恢复甘露糖代谢可增强肿瘤特异性TIL的干性和增殖潜力，并减少耗竭。

对小鼠来源的原代T细胞体外补充D-甘露糖显著增加CD44⁺CD62L⁺T_CM（中央记忆）细胞的百分比和总数以及TCF1表达，且与剂量呈正相关。此外，D-甘露糖处理后细胞高表达Sca-1（干细胞抗原1，细胞干性的另一个标志物），表明T细胞获得了干细胞样T细胞表型。通过TCR激活重新刺激这些细胞来检查这些细胞的增殖能力，D-甘露糖处理的 T 细胞在重复刺激后表现出更优越的生存优势。转录组测序结果表明，D-甘露糖处理导致T细胞干性样表型基因（例如Ccr7和Sell）显著增加，效应基因（例如Gzmb、Ifng、Prf1和Tbx21）减少。而D-甘露糖培养的人源T细胞表现出更高比例的干细胞样群体，这些结果都表明D-甘露糖在体外有效诱导干细胞样T细胞的分化。

转录组数据中还发现D-甘露糖处理会破坏肿瘤细胞的细胞内糖酵解。据此，进行非靶代谢检测，D-甘露糖处理增加了T细胞内糖酵解和三羧酸循环中中间代谢产物的丰度。针对糖酵解与TCA循环进行代谢流分析，观察到D-甘露糖处理确实阻碍了[¹³C₆]-葡萄糖进入糖酵解中间体，同时增强了其进入TCA循环，即发生了糖酵解的抑制以及替代碳源利用的激活。因此，使用 [¹³C₅] 标记的谷氨酰胺和 [¹³C₁₆]标记的棕榈酸酯在 T 细胞中进行示踪实验，发现D-甘露糖治疗可能会使T细胞转向利用谷氨酰胺进行还原羧化，而不是进入 TCA 循环进行氧化代谢。

鉴于D-甘露糖处理显著增加了 T 细胞中α-KG 的丰度（一种调节 DNA 和组蛋白甲基化的关键代谢物），进行了CUT&Tag-seq，D-甘露糖处理下H3K4me3与Tpex/初始T细胞状态相关的转录因子（例如 TCF7 和 LEF1）的结合motif富集，而D-甘露糖处理下与细胞分化相关的基因位点上H3K27me3的富集增加。

非靶代谢的数据中发现D-甘露糖处理导致HBP途径相关的细胞内代谢物发生显著变化，该途径的中间代谢产物UDP-GlcNAc是经典的O-GlcNAc 糖基化的供体，因此进行糖基化水平检测，观察到D-甘露糖处理显著增加了人和鼠 T细胞中O-GlcNAc糖基化蛋白的总水平。其中β-catenin 是一种与Tcf7/Lef1表达相关的转录调节因子，与干性样分化促进有关。此外，放线菌酮 (CHX) 追踪分析表明，D-甘露糖的存在延长了内源性 β-连环蛋白的半衰期。另外，O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）特异性抑制剂OSMI-1的使用能够减轻并抑制D-甘露糖诱导的β-连环蛋白糖基化以及Wnt信号传导，抑制干性样表型，而过表达OGT则增加干性样亚群。因此，D-甘露糖通过 OGT 激活 Wnt/β-catenin信号通路，从而增强β-catenin O-GlcNAc糖基化和稳定性，从而增加TCF1的表达并促进T细胞中的干细胞样表型。

利用有或没有D-甘露糖的情况下体外激活和培养的OVA特异性T细胞构建B16-OVA 黑色素瘤的ACT模型，以验证其抗肿瘤功效，观察到D-甘露糖组肿瘤生长的抑制增强，肿瘤部位、血液、TDLN 和脾脏中转移的OT-I T细胞的百分比和数量升高。对OT-I T细胞的转录组测序表明耗竭相关的基因表达减少。

另外采用K562-CD19异种移植模型评估了D-甘露糖扩增的CD19 CAR-T细胞的抗肿瘤能力，同样观察到D-甘露糖处理增强了肿瘤控制。

使用含有重组人IL-2的对照或D-甘露糖补充培养基进行长时间体外扩增，D-甘露糖处理组CD45RO-CD27⁺干细胞样CD8⁺T细胞亚群的百分比和数量更高，且TCF1表达升高。对长期培养12/36天的细胞分别进行转录组测序，36天的甘露糖组T细胞仍然表达较高水平的干细胞样基因和较低水平的耗竭相关分子，以及类似于记忆 T 细胞的表达特征，表明D-甘露糖处理可以支持T细胞的长期扩增，并在体外保留细胞干性。在异种移植小鼠模型中分别验证其抗肿瘤能力，D-甘露糖处理组也表现出更优的治疗能力。

克服T细胞功能障碍，包括代谢障碍，如葡萄糖、氨基酸和脂肪酸代谢等导致的过继T细胞疗法疗效受损是当前的一大重要挑战。该研究发现补充D-甘露糖促进能够OGT 介导的β-连环蛋白 O-GlcNAc修饰和稳定性，从而增强T细胞干性，因此，通过补充 D-甘露糖增强 T 细胞中的甘露糖代谢，可增强抗肿瘤活性、限制耗竭分化并维持T细胞干性，这为未来开发更高效、持久且经济的T细胞疗法提供了全新的解决方案。