Adv Sci | 复旦与上交大联合筛选高效低毒的结直肠癌靶向治疗药物并深度阐明其药敏机制

先前研究表明，Wnt/β-catenin/转录因子（TCF）的转录过程被激活，对结直肠癌（CRC）致癌过程具有不可或缺的重要性。然而，由于靶向治疗该通路会导致患者出现严重的副作用，使得针对该通路开发的靶向药物一直未用于临床实践中。因此，该文旨在筛选一种兼具抗肿瘤活性和低毒性的结直肠癌治疗候选药物并揭示药物治疗靶点。

为确保后续研究结果准确性，分别从H&E染色、全外显子组测序、转录组测序、Wnt通路富集分数综合评估证实类器官组织与源肿瘤组织存在生理形态、功能、基因突变的一致性。转录组数据GSVA和WB实验表明，随CRC程度加重，Wnt通路转录活性和蛋白水平逐渐增强，而β-catenin的表达较低。KEGG富集表明，CRC类器官中，除Wnt通路外，Notch和Jak/Stat通路也被激活。暗示CRC类器官中存在独立于Wnt/β-catenin通路的肿瘤调节过程。

为缩小靶向治疗结直肠癌的候选关键药物，用已发表的24种Wnt通路靶向抑制剂处理类器官，并结合转录组GSVA-KEGG结果发现，Tegatrabetan、Adavivint、Teplinovivint可抑制Wnt通路的转录调控。药物剂量反应曲线下面积（AUC）显示，Adavivint可抑制CRC类器官生长且对正常结直肠类器官的毒性较低。

裸鼠成瘤模型（PDOX）在体内进一步证实，Adavivint（50mg/kg剂量）可有效抑制CRC生长且不影响小鼠的体重，免疫组化染色（IHC）表明，Adavivint处理降低小鼠的Ki67（肿瘤细胞增殖活性指标）水平，增加caspase3（与细胞凋亡有关）水平。整体结果表明，Adavivnt是一种高抗肿瘤活性，低毒性的候选结直肠癌治疗药物。

使用肿瘤组织、类器官和两例来自TCGA和GEO数据库的RNA-seq数据，利用相关性分析发现ADAM10与Wnt通路和NOTCH通路存在正相关。IP结果表明，ADAM10特异性的直接与NOTCH2结合。使用Adavivint处理CRC类器官，通过WB、RNA-seq、IP、IHC（免疫组化染色）等方式，最终确定Adavivint可增加ADAM10的泛素化水平，特异性减弱ADAM10和NOTCH2的蛋白水平而非转录水平以抑制Wnt通路的激活。

为进一步剖析Adavivint特异性减弱ADAM10 和NOTCH2蛋白水平后，如何抑制Wnt通路的转录过程？对Wnt通路富集评分、Adavivint的AUC值、Wnt通路的四类转录因子（TCF7、TCF7L2、TCF7L1和LEF1）的mRNA进行相关性分析，发现TCF7L2在CRC组织和类器官中表现出最高的mRNA水平，并在Wnt通路的下游基因MYC、JUN、FOSL1、CCND1、CCND2、CCND3启动子处均达到峰值富集。Cut&Tag、qRT-PCR结果表明，NOTCH2和TCF7L2可直接相互作用，该过程会因ADAM10敲低而减弱。在CRC类器官中敲除ADAM10和NOTCH2可降低TCF7L2蛋白的表达。NOTCH2敲低同时会使TCF7L2介导的上述Wnt下游通路基因（MYC、JUN等）表达出现逆转。整体结果表明，ADAM10/NOTCH2/TCF7L2是调节Wnt靶基因转录的旁路信号通路。

为再次验证Adavivint药物是否通过ADAM10/NOTCH2/TCF7L2信号通路抑制Wnt靶基因表达，进而抑制CRC类器官增长？IF结果表明Adavivint处理24h后，可降低细胞膜和细胞质中的ADAM10表达，以及细胞膜、细胞质、细胞核中NOTCH2的表达。处理48h后，可降低TCF72表达。过表达Wnt靶基因（MYC、JUN）可逆转Adavivnt诱导的CRC类器官生长抑制现象。同时，CRC类器官中过表达ADAM10可促进类器官生长，敲低MYC、JUN、NOTCH2可逆转生长过程。

先前研究表明，CRC患者的化疗耐药性与Wnt通路的激活有关。Adavivint治疗是否可减轻CRC化疗的耐药性？使用对亚叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂（FOLFOX）联合治疗存在耐药性的类器官构建FOLFOX耐受类器官。在FOLFOX耐受类器官中Wnt富集评分、ADAM10、NOTCH2、MYC、JUN水平均升高，Adavivint治疗可逆转这一过程。相比单一治疗，Adavivint与FOLFOX的联合用药可有效抑制对FOLFOX治疗中度敏感和耐药类器官的生长过程，且对FOLFOX耐受类器官的影响更大。 同时，ADAM10过表达可诱导对FOLFOX治疗方案的耐药性，通过敲低NOTCH2、MYC、JUN可缓解上述耐药性。