项目文章GUT（IF23）：肠道小菌大作为！南方医科大团队揭示天然产物——葛根素抗动脉粥样硬化新策略
2024-06-24
中科新生命
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动脉粥样硬化（AS）是一种严重的慢性心血管疾病，对全球公共卫生构成重大挑战。近年来，药食同源植物因其天然和安全的特性，作为预防和管理慢性病（包括AS）的方法，受到广泛关注。葛根素（Puerarin，PU）是在葛根中发现的一种天然化合物，具有公认的心血管益处。已有研究表明葛根素可通过减少炎症和改善脂质水平，具有抗动脉粥样硬化特性，然而其治疗作用的机制尚不完全清楚。AS的持续高发病率可归因于多种因素，除遗传因素外，肠道微生物群在介导与高脂肪饮食(HFD)相关的心脏代谢健康中起着关键作用。
为了探讨PU在调节肠道微生物和减轻AS方面的作用机制，2024年5月22日，南方医科大学珠江医院李壮/周宏伟/杨平珍团队在Gut（IF=23）发表题为“Puerarin alleviates atherosclerosis via the inhibition of Prevotella copri and its trimethylamine production”的研究文章，发现在ApoE-/-小鼠模型和AS患者中，葛根素（PU）通过抑制普雷沃氏菌（Prevotella copri）及其三甲胺（TMA）的产生来缓解动脉粥样硬化（AS）。中科新生命参与了该研究中代谢组检测的相关工作。
研究材料
PU、P. copri、ApoE-/-小鼠粪便及血液样本、高脂饮食喂养、AS患者粪便及血液样本
技术路线
步骤1： 使用ApoE-/-小鼠在高脂饮食（HFD）下建立动AS模型，给予PU干预，观察其对AS的影响；
步骤2：进行PU处理的供体小鼠的粪菌移植(FMT)，确认其与AS的关系；
步骤3：微生物测序技术研究PU影响的特定微生物群；
步骤4：分离P. copri，体外培养并检测TMA产生；
步骤5：单菌定植探究P. copri在AS中的因果作用；
步骤6：临床AS患者进一步验证动物模型发现的的结果。
研究结果
1. PU减轻HFD喂养的ApoE-/-小鼠的AS并降低血浆TMAO水平
首先作者使用了ApoE-/-小鼠进行高脂饮食（high-fat diet，HFD），建立AS模型。随后给予PU干预，确认药效。观察其对体重、脂肪积累、斑块形成和炎症因子水平的影响。结果发现PU能够减少体重增加和脂肪积累，减少动脉粥样硬化斑块的形成，降低炎症因子水平，表明PU对改善AS具有积极作用。由于口服给药，PU易于累积肠道，且肠道菌群代谢产物及其氧化产物三甲胺N-氧化物（TMAO）已有研究表明为AS疾病独立危险因素。基于此作者进一步检测小鼠模型血浆三甲胺（TMA）和三甲胺N-氧化物（TMAO）水平。结果表明PU减轻HFD喂养的ApoE-/-小鼠的AS并降低血浆TMAO水平。
图1 PU减轻HFD喂养的ApoE-/-小鼠的AS并降低血浆TMAO水平
2. 粪菌移植实验表明PU对AS的改善作用由肠道菌群介导
为了阐明 PU对AS的改善作用由由肠道菌群介导，作者从PU处理的小鼠中提取粪便微生物(HFD+PU FMT)，移植到HFD喂养的ApoE-/-小鼠中。通过比较接受PU处理的FMT和未接受处理的FMT的小鼠的动脉粥样硬化程度，结果表明接受HFD+PU FMT的小鼠体重减轻，脂肪累积减少；AS斑块病变减少，炎症因子水平降低，并伴随着血浆TMAO浓度显著降低。上述结果表明PU对AS的改善作用由肠道菌群介导。
图2 PU对AS的改善作用由肠道菌群所介导
3. PU通过作用于 P. copri改善AS的具体作用机制
进一步为了探究PU影响的特定微生物群，作者利用微生物测序技术分析了经PU处理和未经处理的 HFD 喂养的ApoE-/-小鼠的肠道微生物。发现PU能够改变肠道微生物的组成，尤其是减少了普雷沃氏菌（Prevotella copri，P. copri）的丰度。此外，Spearman相关分析揭示P. copri与血浆TMAO水平呈正相关性。随后作者分离P. copri， 体外培养实验也表明P. copri促进TMA产生。并通过添加PU证明了其能够抑制TMA产生。随后作者通过流式细胞术分析及基因表达影响表明PU可能通过选择特异性地破坏P. copri的膜功能从而导致其TMA合成减少进而减少TMAO产量，最终对AS疾病具有改善作用。
图3 PU通过作用于 P. copri改善AS的具体作用机制
4. 单菌定植进行机制验证
为了验证关键菌群的调控机制，作者从ApoE-/-小鼠中分离出P. copri，并将其单独定植到HFD喂养的ApoE-/-小鼠中。使用qRT-PCR证实HFD组中P. copri菌的成功定植。通过比较定植P. copri的小鼠和未定植小鼠的动脉粥样硬化程度，研究者们发现P. copri的定植能够增加体重、扩大动脉粥样硬化斑块面积，并提高血浆TMAO水平。同时为了评估PU干预治疗AS的靶点是否与P. copri相关，作者设置HPF+PU和HPF+PU+P. copri两组进行对比，发现在P. copri定植后，PU对AS的改善作用发生了逆转，结果表明P. copri的存在可能会减弱PU减轻AS症状的有效性。
图4 P. copri促进HFD喂养的ApoE-/-小鼠的AS
5. 临床样本表明PU抑制P. copri菌并降低AS患者血浆TMAO水平
为了评估临床环境中P. copri菌、TMAO水平与动脉粥样硬化斑块形成之间的潜在相关性，作者收集了AS患者的样本，进行颈动脉斑块评分、P. copri菌表达量和TMAO水平检测，并进行相关性分析。结果表明AS患者的P. copri的丰度和血浆TMAO水平显著上调，且斑块评分与两者水平均呈正相关。为P. copri菌及其TMA产生参与AS的发生发展提供了临床证据。该研究进一步招募24名被诊断患有AS的患者每天口服PU持续1周，发现P. copri丰度减少，血浆TMAO水平降低。结果表明，PU干预能够缓解AS患者的疾病表型，表明PU在临床应用中的潜力。
图5 PU抑制P. copri菌并降低AS患者血浆TMAO水平
小结
本研究通过多种动物模型加临床实验结合的方法，强调了肠道菌群及其代谢产物对AS疾病发生发展的重要性。首次发现P. copri丰度与AS疾病表型成正相关， P. copri水平可以作为AS诊断的潜在生物标志物。研究表明在ApoE-/-小鼠及AS患者中，葛根素在抑制P. copri丰度及血浆TMAO水平表现出巨大潜力，后续可通过更大规模的临床研究以进一步验证葛根素的疗效和安全性。该研究通过严谨的实验策略为葛根素抗动脉粥样硬化提供了新的见解。
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