Cell Metab | 国内首篇！南医大白晓春/邹志鹏等团队通过somascan蛋白组+单细胞多组学揭示骨源性因子对全身脏器的重要作用

骨骼浸泡在骨髓中，分泌的可溶性因子会进入到骨髓中，因此通过骨髓上清液的蛋白组学鉴定可以鉴定到骨髓来源的细胞因子。这些细胞因子一旦进入血流系统，则对全身的脏器产生影响。本文有多个思路还是非常漂亮，值得针对体液样本进行临床大队列研究的研究者的借鉴：

1.利用血清或血浆样本进行研究大大降低了获取临床样本的难度，然而，外周血包含了来自各个脏器的分泌蛋白，如何鉴定关注器官来源的细胞因子是一个重点难点问题。本研究针对骨骼、骨髓上清液和血清样本的DEGs/DEPs进行取交集，帮助更好地鉴定骨源性因子。

2.外周血蛋白组研究的另外一个难点是检测因子浓度很低，很多关键因子通常低于现有检测技术，如质谱和细胞因子检测的最低检测下限。因此，利用超高灵敏度的蛋白检测技术，鉴定到更多的关注蛋白，是外周血蛋白组研究的关键。本研究利用了高深度蛋白检测技术——SomaScan技术，鉴定到6567个蛋白，为后续各类取交集提供了有效的数据支撑。相对应地，质谱技术仅检测到723个蛋白。

3.外周血蛋白组研究的第三个难点是细胞破裂后内源性蛋白释放到血液中的影响。作者利用了多个数据库中蛋白定位信息排除掉很多干扰，大大提高了数据准确性。这一套算法完全可以应用于所有的体液样本的蛋白组学研究中，帮助更好地筛选关注蛋白。

4.作者也充分利用了公共的单细胞测序数据，对骨源性因子进行了细胞溯源，并且利用细胞通讯分析，鉴定到成骨细胞传递衰老信号至血管平滑肌细胞的关键靶点，FABP3，未来靶向FABP3可能是治疗骨源性衰老引起的动脉粥样硬化的潜在治疗方式。

作者首先利用bulk RNAseq针对C57BL/6成年小鼠的21个器官，78个文库进行全转录组的基因表达分析。这21个器官包含了各类骨骼，如干骺端、骨干、头骨、脊柱、肋软骨，骨髓和骨骼外器官。与骨骼外器官相比，鉴定到252个骨骼特异表达基因（BSGs）。为明确哪些BSGs可以分泌到外周体液中，作者利用质谱、SomaScan和细胞因子检测方法鉴定了骨髓上清液、小鼠血清和人血清的蛋白组。SomaScan是一种基于核酸适配体的蛋白检测技术，一次可检测几千个蛋白，与质谱法相比具有更高的检测灵敏度，对于低丰度的激素和细胞因子检测具有更显著的优势。利用SomaScan技术，作者鉴定到6557个蛋白，而利用质谱仅鉴定到723个蛋白（图1）。

作者将外周检测到的蛋白与BSGs取交集，共鉴定到132个分泌到外周的骨源性分泌蛋白（图2）。

衰老会导致骨质疏松和骨质下降，进而导致骨折。衰老相关骨细胞分泌衰老相关的细胞因子，如炎症相关因子、ECM降解蛋白等，对于骨骼及全身脏器都有危害。最新研究表明衰老具有个体间和脏器间的异质性，据此，作者推测，骨骼衰老可能会分泌衰老相关骨源性因子影响其它脏器的衰老。作者利用bulk RNAseq、骨组织、骨髓上清液和血浆的蛋白组针对年轻小鼠和衰老小鼠进行多组学研究。值得注意的是，在二阶段的血浆蛋白组研究中，作者采用了SomaScan蛋白组技术，可见相较于质谱和细胞因子检测方法，SomaScan为作者提供了更大的价值。

作者在年轻组和年老组间，干骺端鉴定到了2211个差异表达基因（DEGs），骨干鉴定到了1185个DEGs，骨骼组织鉴定到了976个差异蛋白（DEPs），骨髓上清液鉴定到了560个DEPs，血浆鉴定到1285个DEPs。

前面有提到血浆蛋白组的检测无法区分分泌蛋白还是细胞破裂引起的内源性蛋白释放，作者这里发明了一个Integrated secretion analysis（ISP）算法鉴定分泌蛋白，具体包括以下步骤：

（1）鉴定到的蛋白用GO的cellular component为“extracellular locations”进行第一步narrow down；

（2）用Uniport关键词是“secreted”进行第二步narrow down；

（3）用SignalP，TMHMM和SecretomeP进行蛋白定位预测。其中SignalP是用来预测蛋白是否通过信号肽经典途径分泌，SecretomeP是用于预测蛋白是否通过非经典途径分泌，TMHMM是用来鉴定跨膜蛋白，一般跨膜蛋白是比较难于分泌到胞外的。具有信号肽的，非跨膜定位的，SecretomeP预测值大于0.6的蛋白，补充到步骤1和2narrow down之后的蛋白，这些蛋白被定义为分泌蛋白。

基于ISP分析，作者鉴定到203个AOKs。这些AOKs主要是ECM相关蛋白，这些蛋白在衰老的骨骼和骨髓上清液中表达下降，可能与骨密度下降、骨质疏松密切相关。此外，作者也鉴定到了炎症相关的因子，这些因子在衰老的组织中表达更高（图3），这与前人报道的衰老骨骼中表达更高的炎症因子是一致的。

人体的骨骼如果长时间接受外部的压力，就会增大骨密度和坚硬程度，即沃尔夫定律。然而，机械应力如何调节骨源性因子，其机制还不甚清晰。

胫骨负荷实验和悬尾实验通常用来分析小鼠接受外部机械应力后的响应。作者利用bulk RNAseq、骨组织、骨髓上清液和血浆的蛋白组针对接受胫骨负荷实验和悬尾实验小鼠和对照处理小鼠进行多组学研究。鉴定到一系列的DEGs和DEPs，并且通过ISP分析，鉴定到100个MOKs，其中33个是ECM蛋白（图4）。

成骨细胞具有很强的分泌功能，于是作者也关注了成骨细胞产生的骨源性分子。针对细胞来源的分析，作者分析了公共的单细胞测序数据，鉴定到7726个细胞，包括成骨细胞、软骨细胞等，并鉴定到339个成骨细胞特异表达的基因。

为鉴定成骨细胞分化和衰老相关的分泌蛋白，作者体外培养了成骨细胞，并进行不同培养时间和成骨诱导处理，针对条件培养基进行质谱分析，鉴定到1217个成骨分化相关蛋白，1000个成骨衰老相关蛋白。而后作者与成骨细胞特异表达基因取交集，鉴定到86个蛋白，其中50个是分泌蛋白，即OBKs（图5）。

如前所述，作者针对四种模型进行了骨源性因子的鉴定，共鉴定到375个骨源性因子，其中107个BOKs，203个AOKs，100个MOKs，50个OBKs。作者也比较了SomaScan和细胞因子检测方法鉴定到的蛋白数目，利用细胞因子检测仅能检测到62个骨源性因子，而SomaScan可以鉴定到328个骨源性因子（图6）。

目前的单细胞测序研究可以在单细胞层面分析细胞之间的异质性，因此可以就关注的分泌蛋白进行细胞溯源。作者利用了公共的单细胞测序数据，对375个骨源性因子进行溯源，其中345个都溯源到了细胞类型。并且就部分因子做了进行了免疫组化验证（图7）。

细胞之间，包括不同脏器细胞之间可以通过配体和受体的结合，激活细胞内的信号传导。而利用单细胞测序数据进行CellChat分析。作者利用多个器官的单细胞测序公共数据，进行CellChat分析，重点关注骨源性因子的细胞通讯分析。例如，Spp1在成骨细胞、软骨细胞、骨髓来源基质细胞表达，其受体integrin在血管平滑肌细胞表达，说明了这两类细胞的通讯。而后作者用NicheNet分析了配受体结合后细胞内的信号传导，并对信号通路进行KEGG富集分析，结果显示其主要富集于脂质和动脉粥样硬化、衰老等通路。以上结果提示了骨骼对全身脏器的作用，尤其是对血管平滑肌细胞相关的动脉粥样硬化（图8）。当然，对于生信分析结果的生物学验证，还是非常重要的。

骨质疏松和动脉粥样硬化都是衰老相关疾病，目前已有一些研究报道提示两者的相关性，并且治疗骨质疏松的药物也可以一定程度上抑制动脉粥样硬化，其机制还尚不知晓。作者利用一个GWAS数据进行了孟德尔随机化分析，鉴定到低骨密度是动脉粥样硬化的风险因素。

作者推测AOK可能跟骨质疏松促进的动脉粥样硬化相关。通过对骨髓上清液的蛋白组数据看，FABP3是一个高度表达的AOK，是一个脂肪酸结合蛋白，参与长链脂肪酸的运输。FABP3抑制骨髓基质细胞的成骨作用，促进血管纤维化，可能是骨缺失引起心血管疾病的调控因子。血浆中FABP3表达也与衰老正相关，mRNA和蛋白的结果也显示FABP3在衰老骨骼中表达高，但是在心脏和骨骼肌中，其表达并不与衰老相关。此外，Fabp3主要在成骨细胞中表达，并且随着衰老表达逐渐提高。因此，作者推断，血浆中随年龄增高的Fabp3蛋白是由骨骼的衰老决定的。

为验证FABP3在动脉粥样硬化中的作用，作者用重组合成的FABP3蛋白处理动脉粥样硬化相关的细胞，包括内皮细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞，而后鉴定衰老相关marker的表达，结果显示，FABP3处理促进血管平滑肌细胞P21,P27和P53的表达，而内皮细胞和成纤维细胞的表达提升则非常微弱，衰老燃料SA-β-gal染色也得到一致的结论。作者又用成骨细胞的条件培养基处理血管平滑肌细胞，也得到了一致的结论。作者又将FABP3处理的血管平滑肌细胞进行了RNAseq分析，鉴定到衰老、脂质代谢等一系列通路的富集（图9）。以上结果提示了衰老成骨细胞分泌的FABP3在促进血管平滑肌细胞衰老的重要作用，这为骨质疏松和动脉粥样硬化的关系提供了合理的解释。