Cell: AI+SomaScan液体活检，构建眼睛为窗口的“衰老时钟”

1.样本信息：120例液体活检样本。详细信息如下：

①鉴定细胞类型特异性标记蛋白：12例健康房水（AH）和12例健康玻璃体样本；

②构建人工智能衰老模型：34例健康AH和①中12例健康AH样本；

③疾病样本：15份糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy ，DR）患者、10份糖尿病但无DR患者、6份葡萄膜炎患者、7份视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）患者、5份PD患者、19份白内障患者的AH样本；

2.组学选择：SomaScan

利用SomaScan共检测出6345种蛋白质，其中房水与玻璃体中检测出的蛋白有87%的重叠度，表明两种组织中存在大量蛋白质交换（图2A）。结合已发表的眼部和眼外scRNA-seq数据，有5923种蛋白质在RNA-seq数据中确认了相应基因的表达，对其进行无监督聚类分析，发现其呈现细胞类型依赖，而非组织类型依赖（图2B）。多组学数据整合鉴定出1920种细胞类型标记蛋白，在各自细胞类型中具有高度特异性表达（图2C），如：神经节细胞（n=114）、锥状光感受器（n=56）、T细胞（n=33）。整体数据表明，可以在不需要直接组织活检的情况下，通过液体活检中的细胞特异性蛋白质，实现对非再生组织疾病的活体细胞类型进行分子监测。

RP是一种罕见的遗传性视网膜疾病（图3A），为从分子层面评估活人RP的病理。作者对已鉴定的1920个细胞类型特异性标记蛋白进行丰度分析，发现杆状光感受器特异性蛋白在RP患者中显著减少，锥状光感受器、视网膜双极细胞、视网膜无突细胞、红细胞、血管内皮细胞的标记蛋白减少次之。而其他类型的视网膜细胞，包括水平细胞和神经节细胞，相对不受影响（图3B）。

用同样方式对葡萄膜炎患者进一步分析，发现各种免疫细胞的数百种标记蛋白显著增加。同时，部分视网膜细胞也出现一定的分子损伤。

根据血管损伤和血管通透性可将DR发病阶段划分为：健康期、非增殖期（NPDR）、增殖期（PDR）（图4A）。当前，多使用成像技术评估DR视网膜结构变化，为明确DR发病进程中关键的细胞驱动因素，作者对DR患者房水中，细胞类型特异性标记蛋白变化进行分析，发现相比于健康人群，DR中共有58种血管生成蛋白差异富集，有29种蛋白在PDR中特异性升高，其中包括VEGFA，该蛋白是PDR和NPDR的治疗靶点。桑基图表明，PDR特异性血管生成蛋白主要来自于一些免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、视网膜小胶质细胞（图4C）。不同于NPDR，PDR是由一组独特的血管生成细胞和血管生成因子驱动。

由于脑组织活检极为复杂，神经退行性疾病（如帕金森病，PD）的诊断和预后评估通常具有挑战性。作者发现PD患者和对照患者的房水之间存在明显差异，有18个PD相关蛋白质在房水中检出，其中9个在PD中显著升高（图5A）。细胞类型涉及神经节细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞、锥细胞和杆状细胞（图5B）。同时，作者还发现杆状和锥光感受器特异性蛋白质丰度发生变化，此信息并未通过解剖数据观察到，暗示分子生物标志物可能比成像、结构生物标志物更敏感，该结果在分子和细胞水平上重新定义了视网膜中的PD表型信息。

多项研究表明，组织的功能老化与生物体的实际年龄存在差异。为剖析哪些细胞驱动了眼睛功能衰老。随后，作者发现在健康眼睛中，有6313种蛋白随着衰老而出现波动变化（图6A）。无监督分层聚类分析将6313种蛋白质分为10个具有相似轨迹的Cluster（图6B）。随着年龄增长，几乎所有的Cluster都显示出非线性轨迹，其中有7个Cluster富集到生物通路和特定细胞类型。如晶状体和睫状体特异性蛋白在50岁左右达到峰值（Cluster6，图6H）；来自免疫细胞的蛋白质，如巨噬细胞、中性粒细胞和视网膜小胶质细胞在80岁之前保持相对稳定，然后显著增加（Cluster2，图6D）；来自视网膜细胞的蛋白质，包括锥细胞和神经节细胞，从80岁左右开始急剧下降（Cluster9，图6K）。整体结果表明：①眼睛蛋白质组在正常衰老过程中的变化主要沿着非线性轨迹；②衰老过程可能在很大程度上是器官特异性的；③特定的途径和细胞类型在眼睛和衰老过程中起着关键作用。

最后，作者在46名健康患者的训练队列中训练了10倍交叉验证的XGBoost模型，已预测患者的实际年龄，该模型在19名健康患者的独立独立额中进行了前瞻性验证，结果表明该验证队列具有较强的年龄预测能力，表明AI可以准确评估健康眼睛的分子年龄（图7A-C）。进一步将模型应用于与生理年龄无关的眼病患者中，发现NPDR患者、PDR患者、RP患者、葡萄膜炎患者预测的分子年龄均比健康患者大，暗示患病的眼睛会加速衰老，为衰老和疾病过程之间的重叠提供了迄今为止最有力的分子证据。

随后，作者进一步探讨疾病是否与特定细胞类型的加速衰老有关。利用人工智能，根据各自细胞类型的特异性蛋白质来预测血管、免疫和视网膜年龄，发现在训练组和验证组中，眼病涉及疾病特异性细胞类型的加速衰老：如PDR中的血管细胞，葡萄膜炎中的免疫细胞、RP中的视网膜细胞。同时发现，在没有任何临床可见的视网膜病变迹象的糖尿病患者中，免疫细胞和视网膜细胞的加速衰老已经开始。进一步强调评估细胞类型特异性衰老而不是整个器官衰老的潜在重要性，且分子评估可能比目前的临床成像技术更敏感。

（1）为什么是SomaScan：房水的蛋白质组学分析一直受其低体积和低蛋白浓度的挑战，利用SomaScan可实现低样本量的蛋白质组深度检测，确保了房水样本中蛋白质的高效检出，为发现大量先前从未报道过的房水和玻璃体中共有蛋白质奠定重要基础，也会后续准确挖掘蛋白质标志物提供有力保障；

（2）液体活检样本发现潜在干预靶点：眼睛，大脑等这类非再生器官，人体活体取样是极为艰难的，而小的活检组织可能会错过细胞异质性中的关键疾病区域。利用房水、玻璃体的组织特殊性可直接揭示眼睛衰老的蛋白质标志物并溯源驱动眼睛衰老的细胞类型。该研究策略同样适用于脑（脑脊液）、肺（支气管肺泡灌洗液）、肾（尿液）、乳房（母乳）、关节（滑液）等研究领域。