当时空组学遇到类器官，多次元碰撞

Human ESCs，脑类器官

本研究首先揭示不同脑类器官方案对组织形态的影响，测试了小分子、基质(MG)暴露和生长因子在神经上皮扩张过程中的胚状体(EB)模式。在第3、5和18天捕捉对早期EB形态和后期神经上皮形态的影响，无论哪个时间点，COs与其他条件表现出一致的形态距离。

通过免疫组化检查宏观结构，发现与未处理的类器官相比，生长因子处理的类器官的脑室更多、更大。对TBR2+ (EOMES)中间祖细胞(IPCs)和HuC/D+神经元的定量显示，与未处理的生长因子处理的类器官相比，这些分化程度更高的细胞类型的数量有减少的趋势；对同一类器官的表面复杂性参数和宏观结构参数进行分析，显示脑室越多的类器官脑室也越大。摇床扰动测试结果显示影响大体形态的机械因素也影响宏观结构。第45天分离成熟COs重新聚集单细胞悬液(DISS)，10天后分析研究细胞结构破坏的特征，发现DISS类器官完全缺乏可识别的脑室，极化的SOX2+ VZ上皮消失，TBR2+ SVZ和BCL11B+皮质板(CP)的空间分离也消失。

通过形态学扰动，对第55天的类器官进行了单核RNA测序(snRNA-seq)，12个独立的类器官中获得30,366个细胞，鉴定到不同且多样化的祖细胞和神经元亚群，检测到大量的非根尖IPC和外部RG祖细胞，尽管DISS样品与COs来自同一细胞系、培养条件、批次甚至同一培养皿，但细胞结构破坏显著改变了它们的细胞组成，DISS类器官显示出UL、DL和迁移神经元减少，但在其他细胞类型如皮质边缘、分化RG、CR细胞和INs中富集。解离和重新聚集导致循环祖细胞和分化RG的增加，表明组织对潜在的细胞损失和细胞应激的可塑性反应。查看每个类器官图像的形态学，即小叶结构和大小的显著差异，形态越复杂的CO noMG对不同细胞类型的表征越好，与体内相似度也越高，这表明细胞身份可能更多地与类器官的形态有关。

根据形态学的复杂程度将snRNA-seq聚类标记为高分形态学(high-score morphology, HSM)和低分数形态学(low-score morphology, LSM)， LSM聚类包含了DISS条件下的所有样本（更小、更简化）。大多数HSM样本相比较LSM更接近体内数据，表明具有更复杂形态的类器官更好地模拟了体内表达谱。结合两个体内大脑发育数据集，HSM在与体内匹配方面表现更好，表明形态与体内的转录组相似性相关，可用来预测类器官的质量。对LSM类器官和HSM类器官的snRNA-seq景观进行了差异丰度分析。富含LSM cluster表现出形态发生的GO条目上调，也表明形态和组织细胞类型组成密切相关。

空间转录组在保留细胞类型和细胞位置方面有前所有的优势，简单细胞结构的CO noMG类器官显示稀疏的RG标记(PAX6, SOX2, FAM107A, MOXD1和TNC)扩散到神经元区域，而具有适当心室结构的CO和CO noMG中，RG标记限制在VZ，表明具有简单细胞结构的类器官在空间中的基因表达谱异常。整合snRNA-seq和空间数据，在具有复杂细胞结构的CO和CO noMG中，RG细胞映射到VZ，被SVZ中的IPCs包围。与snRNA-seq分析结果一致。进一步支持了复杂的组织结构和离散的心室对于细胞类型的完整发育及其空间定位是必要的。

单细胞测序结果通过拟时序分析发现，与体内发育一致，神经祖细胞位于分化轨迹的根部，其次是基底祖细胞、迁移神经元、DL神经元，最后是UL神经元，成熟兴奋性神经元和Ins，再将潜在时间投影到空间转录组景观上。在具有复杂细胞结构的CO和CO noMG中，由此产生的转录动力学与体内已知的谱系空间方向性高度一致，组织发育方向从VZ开始，终止于CP，晚熟区对应于晚出生的UL神经元，但这些时空轨迹在细胞结构更简单的CO noMG中被破坏。

snRNA-seq数据分析HSM和LSM类器官的差异表达基因，祖细胞相关的差异表达基因与不同形态相关的总体基因表达趋势相似，与形态无关。神经元对应体的发育过程显示，LSM神经元群体中祖基因的表达仍然上调，而HSM神经元群体的表现与预期一样，没有祖基因的表达，这一发现强化了组织形态与时间命运相关。与整个类器官冷冻细胞核结果相比，解离类器官的细胞核在细胞类型组成上没有显著差异，同样，当DISS样品在重组后3天进行分析时，细胞类型与第45天细胞核的转录谱相匹配，这表明机械扰动本身并不影响转录组特征。scRNA-seq分析结果显示与CO相比，DISS和CONS类器官对转录景观的影响惊人地相似。总之，细胞结构重组或形态扰动等在空间上被破坏的细胞，在时间上分化成具有被破坏身份的细胞。