Cell子刊（IF 14.3）|海军军医大学张卫东和上海中医药大学刘三宏团队揭示海洋天然产物小分子促进抗肿瘤免疫的直接作用机制！
2024-03-07
中科新生命
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阻断PD-1和PD-L1的结合可以重新激活细胞毒性T细胞对肿瘤的杀伤作用，是一种重要的肿瘤免疫治疗方式，但是PD-1/L1单抗在肿瘤应答率等方面仍有不足。相反，小分子抑制剂在这方面就体现出了先天的优势。
2024年2月20日，海军军医大学张卫东和上海中医药大学刘三宏团队在Cell Reports Medicine（IF 14.3）发表了关于海洋天然小分子Benzosceptrin C通过靶向DHHC3降解PD-L1发挥免疫抗肿瘤方面的最新研究成果“Benzosceptrin C induces lysosomal degradation of PD-L1 and promotes antitumor immunity by targeting DHHC3”。
研究结果
1. Benzosceptrin C（BC）能够显著下调肿瘤细胞PD-L1的表达从而增强T细胞抗肿瘤活性
作者选择RKO细胞作为工具细胞，筛选天然化合物寻找潜在的PD-L1抑制剂。实验发现，BC是一种新的PD-L1负调控分子，即BC降低了CRC细胞中PD-L1的表达。进一步的研究表明，BC主要通过下调PD-L1的表达来增强T细胞对CRC细胞的杀伤作用。
图1 BC可促进RKO细胞中PD-L1的降解
图2 BC可以减弱肿瘤细胞结合PD-1的能力，增强T细胞的细胞毒性，介导T细胞依赖性的抗肿瘤作用
2. BC通过溶酶体途径促进PD-L1降解
作者发现，BC诱导的PD-L1下调主要控制在蛋白水平而非mRNA水平。相关溶酶体途径抑制剂均能逆转BC对PD-L1蛋白的抑制。转录组测序结果表明，多个溶酶体相关基因表达上调，包括RAB7A、溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)、LDLR和NPC1，进一步证实BC能够影响溶酶体的功能。鉴于PD-L1通过溶酶体途径降解主要涉及蛋白水平的变化，研究者也对BC处理的细胞进行了蛋白质组学分析，结果发现KEGG富集到溶酶体途径最多。这些结果表明BC介导的PD-L1降解是通过溶酶体依赖途径介导的。
图3 BC诱导PD-L1的溶酶体依赖性降解
3. BC通过直接结合DHHC3抑制DHHC3活性
为了探索BC降解PD-L1的作用靶点，本研究利用药物亲和反应靶点稳定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)鉴定与BC直接相互作用的蛋白靶点。在分析排名靠前的基因时发现BC可能直接作用于棕榈酰基转移酶。为了鉴定CRC中主要的棕榈酰基转移酶，于是建立了结合蛋白表达、亚细胞定位和功能缺失试验的筛选方法。首先，从人类蛋白质图谱中列出了所有在CRC中表达的DHHCs。进一步排除了位于细胞核(与PD-L1缺乏空间重叠)的DHHCs，提出了有待实验验证的候选基因，包括DHHC2、DHHC3、DHHC4、DHHC6、DHHC8、DHHC11、DHHC13、DHHC17、DHHC21和DHHC24。逐一敲低这些基因后发现敲低 DHHC3后会减少 PD-L1 蛋白表达。免疫共沉淀和免疫荧光实验显示PD-L1 和 DHHC3 之间存在相互作用。
为了确定BC是否与DHHC3蛋白直接结合，作者使用了细胞热移位实验(CETSA)、微量热泳动(MST)和分子对接对BC和DHHC3之间进行了直接结合分析。这些实验法证实了BC与DHHC3的直接结合。并且一旦DHHC3上Thr176、Glu223和Cys156三个位点全部突变为丙氨酸，DHHC3和BC的结合就消失了。进一步的分析表明，BC通过靶向DHHC3阻断PD-L1的棕榈酰化，进而加速PD-L1的降解。
图4 BC通过DHHC3乙酰转移酶影响PD-L1的棕榈酰化
图5 BC直接结合并抑制DHHC3活性
4. BC与抗CTLA4联合使用可有效抑制肿瘤生长
临床上，抗PD-1和抗CTLA4药物联合治疗较PD-1单药治疗具有更高的应答率，可显著提高肿瘤患者的应答率和生存率。接下来，作者研究了BC联合抗CTLA4治疗是否具有协同抗肿瘤作用。结果表明，BC和抗PD-L1之间不具有协同作用。通过分析TILs，发现联合组的CD8+T细胞数量和CD8+/CD4+T细胞比值均高于单独治疗组。髓系衍生抑制性细胞(MDSCs)和Tregs被认为是肿瘤微环境中两个主要的免疫抑制群体，可以通过抑制T淋巴细胞免疫导致肿瘤免疫逃逸。流式细胞术分析显示，与单独处理组相比，联合组显示出MDSC(CD11b+Gr1+)和Treg (CD4+CD25+FOXP3+)积累的显著减少。这一结果也被免疫组织化学所证实。总之， BC是一种很有前途的药物，可以提高抗肿瘤免疫，并在抗CTLA4免疫检查点阻断免疫治疗。
图6 BC和CTLA4联合抑制肿瘤生长
5. 人肿瘤组织中DHHC3和PD-L1的蛋白表达水平
为了在人体肿瘤组织中验证上述结果，本研究评估了6例结肠癌患者的癌旁组织和肿瘤组织中DHHC3和PD-L1的蛋白表达水平。结果显示，4例患者的癌旁组织和癌组织的表达与预期一致。此外，在TCGA数据库中的GEPI分析也显示，CD274和DHHC3在癌组织中的表达高于癌旁组织，但无显著差异。与WB结果一致，4例CRC组织免疫组化样本显示DHHC3与PD-L1表达呈正相关。此外，在结直肠癌和总癌症中，相关系数分别为0.21和0.25。这些结果表明DHHC3对PD-L1的棕榈酰化修饰使其在CRC中稳定存在。
图7 结直肠癌组织中DHHC3与PD-L1表达的相关性
总结与讨论
重要性：PD-L1小分子抑制剂由于分子量较小，免疫原性可以忽略不记。靶向调控PD-L1表达的小分子有可能成为一种新的治疗方式，因此寻找调控PD-L1表达的天然小分子将成为免疫治疗过程中的新方案。
创新性：该工作为小分子药物调控PD-L1的靶标发现和机制研究提供了一种新思路。
拓展性：基于前期获得的筛选数据结合人工智能，通过算法进一步精确定位潜在调控PD-L1的小分子，缩短筛选时间。也可通过对已经上市的药物进行筛选，发现一些能够老药新用的上市药物。同时，再结合多种蛋白质组学技术以及生物信息手段，对筛选到的小分子进行深入研究。
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