Nature Communications（IF 16.6）| 单细胞和空间转录组学分析预测口腔鳞状细胞癌生存和靶向治疗反应

10个HPV(-)OSCC患者新鲜冷冻组织

10名患者的12份新鲜冷冻的OSCC样本进行了ST检测，把ST数据和HNSCC scRNA-seq数据集进行综合分析，确定了病理标记的鳞状细胞癌区域中存在的恶性肿瘤细胞和其他细胞亚群的组成。为了识别恶性肿瘤点，将恶性细胞定性为具有反卷积评分>0.99或CNV概率评分>0.99。CNV分析显示3号染色体出现反复缺失，9号染色体出现扩增。根据应用的高置信度截断，12个样本均为空间反卷积或CNV推断的癌细胞，结果产生13950个恶性spot和10852个非恶性spot。

恶性spot分3个主要簇，通过差异基因表达分析(DGEA)，在cluster1中富集DEGs包括参与角化SPRR2D、SPRR2E、SPRR2A和EMT DEFB4A和LCN2抑制的基因，而在cluster3中富集DEGs包括参与ECM基质COL1A1、FN1、COL1A2、TIMP1、COL6A2基因。在cluster2中富集DEGs具有cluster 1和3共同属性。将cluster 1注释为“肿瘤核心”(TC)，将cluster 3注释为“边缘”(LE)。cluster2注释为“临时”。每个患者的TC和LE表达相关性相对较低，突出其肿瘤微环境中的异质性。LE高表达与细胞周期、上皮-间质转化(EMT) 、血管新生相关的基因，在TC中上调的细胞功能标志包括角化、细胞分化及抗菌和免疫相关途径，而在LE中上调的是蛋白质翻译和核糖体相关途径，Ingenuity Pathway Analysis（IPA)预测了GP6、EIF2和HOTAIR调节规范信号通路在LE中激活，可能反映了OSCC的 LE在调控侵袭性和转移性行为中的作用。在TC中，观察到巨噬细胞、IL-33和p38 MAPK经典信号通路中MSPRON信号的激活，OSCC基因可调节肿瘤微环境中的免疫反应。利用单细胞调节网络推理与聚类(SCENIC)来推断转录因子(TF)活性，在TC中发现几种原致癌TF和肿瘤抑制因子上调。在LE中观察到包括细胞发育和分化调节、EMT调控基因上调，突出了纤维血管壁龛的存在。

癌症干细胞(CSCs)是一种具有干细胞样祖细胞和恶性特性的癌细胞。CSC标记物表达在UMAP投影中均匀可见，表明在整个OSCC肿瘤中及非干细胞样恶性细胞都存在CSC。TC和LE的不同生物学特征可以通过独特的癌细胞状态来解释，即由特定肿瘤微环境相互作用动态表现的保守基因表达程序，包括CSC和非干细胞样恶性细胞，证实了LE中高表达间充质样CSC状态 (p<0.001)，TC高表达上皮样CSC状态(p<0.001)。免疫荧光进一步验证了CSC状态定位，加强了TC和LE生态位的可塑性，促进了转录独特的癌细胞状态的扩散。TC-TC信号传导通过DSC2-DSG1和ANGPTL4-SDC1等，涉及癌症转移的主要途径。LE-LE通过LAMB3- ITGA6_ITGB4和LAMB3-ITGA6_ITGB1以及炎症配体受体对MIF-CD74_CD44（已被鉴定为启动致癌信号通路）发出信号。TC邻近大量的巨噬细胞，并一起参与黏附桥粒和钙粘蛋白(CDH)信号通路，巨噬细胞和细胞毒性CD8(+) T细胞也参与了LE和ECM的细胞间信号传导。myCAF细胞类型与LE的通讯相比较LE-LE、TC-TC凸出，通过层粘连蛋白和胶原信号通路，突出了其在癌症信号传导中的突出作用。综上所述，TC和LE中的恶性细胞参与不同的细胞间通讯模式，进一步塑造了它们独特的生物学特性。

对TC spot、LE spot和其他剩余spot训练了三个基于机器学习(ML)概率的预测模型，以生成一个空间-区域预测模型。将ML模型应用于17种不同癌症类型，将每个样本中的每个斑点描述为“TC”，“LE”，“暂时”或“其他spot”。在黑色素瘤(SKCM)、结直肠腺癌(COAD)、皮肤鳞状细胞癌(cSCC)样本和宫颈鳞状细胞癌(CESC)样本的癌细胞状态空间分离方面表现良好，这可能归因于这些癌症中存在角化程序；结果表明，LE相关的表达状态在多种癌症背景下是保守的，与TC相关的表达谱更具组织特异性。

LE状态在不同的癌症类型中具有普遍性，引用TCGA中20个常见的实体肿瘤确定LE特征对预后的影响，在多种癌症中，除了乳腺癌(BRCA)的总生存期(OS)和肺鳞状细胞癌(LUSC)的疾病特异性生存期(DSS)之外，高LE评分始终与更差的OS和DSS相关。而较高的LE特征评分与任何临床特征无关，表明除了CAF外，还有其他未知机制驱动与LE相关的生存结果。

在空间反卷积的癌细胞聚集在所有样本中，通过RNA速度分析发现这些空间上独特的癌症状态是由一个分化层次控制的，这个分化层次由TC的祖细胞样癌细胞状态发展到LE的更特化的癌细胞状态组成。TC状态的癌细胞可以通过逐渐获得更具侵略性的EMT样表型转变为LE状态，从而促进癌症的侵袭和传播。多项研究已经描述了转录独特的癌细胞状态的存在，本研究表明，这些状态也受到空间调控。

将RNA速度应用于ST数据以预测药物反应。有效的药物(高AAC值)通常被用于诱导LE状态逆转的外向转变概率，突出了LE作为全局治疗靶点的重要性。一些药物可能通过诱导癌细胞转化为TC状态来进一步赋予其功效。假设有效的抗癌药物指导从LE状态向TC状态的转变，从而通过抑制侵袭性/转移性信号使这些细胞的表型不那么具有攻击性。Alvocidib是一种CDK抑制剂，正在研究其在急性髓系淋巴瘤(AML)中的应用，在本分析中显示出高于平均水平的外向LE和传入TC的短暂信号，Alvocidib可能是待研究的候选药物。