寡核苷酸药物分析：新兴方法及其应用
2023-09-28
中科新生命
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目前，我国暂时没有寡核苷酸类药物CMC相关的指导原则。FDA也仅针对个体化的寡核苷酸药物发表过《用于严重衰弱或危及生命的疾病的个体化反义寡核苷酸药物制剂的IND申报:化学、制造和控制建议》（IND Submissions for Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases: Chemistry, Manufacturing, and Controls Recommendations）[4]。
在FDA的建议中，提到应使用两种或两种以上的方法对ASO进行鉴别，推荐的方法包括分子量测定和MS/MS测序，此外，测定Tm值和HPLC色谱保留时间也可以作为鉴别手段。但是，由于寡核苷酸药物的二级质谱碎裂模式较为复杂，对于具有多种修饰的寡核苷酸药物，MS/MS测序不一定能获得良好的匹配结果。对于此类寡核苷酸药物，还可考虑采用粗产物失败序列分析[5]、核酸外切酶末端降解测序[6]以及核酸酶P1 mapping[7]等多种方法进行序列确证。
FDA的建议中同样提到，应对ASO的产品相关杂质根据结构或者保留时间进行分组，并对每个杂质或每组杂质进行定量。对寡核苷酸药物进行杂质分析的方法，有经典的离子对反向色谱法（IP-RP）和阴离子交换色谱法（AEX）等。由于寡核苷酸药物的分子量较大，且携带多个负电荷，亲水性较强，需要使用三乙胺等离子对试剂，来改善其在反向色谱上的保留，配合使用HFIP，还可以实现质谱兼容。在进行IP-RP分析时，离子对试剂的种类、浓度、柱温、流动相pH值等多种因素均会影响其分离效果[8]。AEX则是根据分析物在表面负电荷数量和位置的差异分离分析物，由于寡核苷酸药物骨架上的磷酸基团上带负电荷，因此AEX也是寡核苷酸杂质分析和含量检测的常用方法。此外，AEX还可以一定程度上实现对硫代磷酯键修饰的寡核苷酸的立体异构分辨，为其立体异构的表征提供依据[9]。
近期，也有多种其他分析方式被用于寡核苷酸药物的表征和杂质分析中。如Huang等人采用亲水相互作用色谱法（HILIC）来对寡核苷酸进行分析，该方法可以避免离子对试剂的使用，且可以在非变性条件下与质谱联用，实现双链native分子量的检测，该方法对杂质的分离效果也十分优秀[10]。Roussis等人采用弱阴离子交换色谱法（WAX）来改善硫代磷酯键修饰的寡核苷酸的杂质分离，实现了优于AEX的分离效果[11]。
中科新生命针对主要的寡核苷酸药物（ASO和siRNA）开发了多种表征检测方法和杂质分析方法，可以使用多种不同原理的方法对原料药进行全面的表征和杂质分析。欢迎各位老师前来咨询！
[1] Lemaitre MM. Individualized Antisense Oligonucleotide Therapies: How to Approach the Challenge of Manufacturing These Oligos from a Chemistry, Manufacturing, and Control-Regulatory Standpoint. Nucleic Acid Ther. 2022 Apr;32(2):101-110.
[2] Capaldi D, Teasdale A, Henry S, Akhtar N, den Besten C, Gao-Sheridan S, Kretschmer M, Sharpe N, Andrews B, Burm B, Foy J. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products. Nucleic Acid Ther. 2017 Dec;27(6):309-322.
[3] Lemaitre MM. Individualized Antisense Oligonucleotide Therapies: How to Approach the Challenge of Manufacturing These Oligos from a Chemistry, Manufacturing, and Control-Regulatory Standpoint. Nucleic Acid Ther. 2022 Apr;32(2):101-110.
[4] https://www.fda.gov/media/154664/download
[5] Juhasz P, Roskey MT, Smirnov IP, Haff LA, Vestal ML, Martin SA. Applications of delayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry to oligonucleotide analysis. Anal Chem. 1996 Mar 15;68(6):941-6.
[6] Pieles U, Zürcher W, Schär M, Moser HE. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: a powerful tool for the mass and sequence analysis of natural and modified oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 1993 Jul 11;21(14):3191-6.
[7] Jones JD, Grassmyer KT, Kennedy RT, Koutmou KS, Maloney TD. Nuclease P1 Digestion for Bottom-Up RNA Sequencing of Modified siRNA Therapeutics. Anal Chem. 2023 Mar 7;95(9):4404-4411.
[8] Kadlecová Z, Kalíková K, Tesařová E, Gilar M. Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography: Effect of ion-pairing system. J Chromatogr A. 2022 Aug 2;1676:463201.
[9] Cook K, Thayer J. Advantages of ion-exchange chromatography for oligonucleotide analysis. Bioanalysis. 2011 May;3(10):1109-20.
[10] Huang M, Xu X, Qiu H, Li N. Analytical characterization of DNA and RNA oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2021 Jul 5;1648:462184.
[11] Roussis SG, Rentel C. Separation of phosphorothioate oligonucleotide impurities by WAX HPLC under high organic content elution conditions. Anal Biochem. 2022 Dec 15;659:114956.
