项目文章Cell Death and Disease（IF 9.0）| 华山医院利用蛋白组学代谢组学联合分析揭示膀胱癌顺铂耐药性

人和鼠膀胱癌细胞SV-HUC-1、RT4、UM-UC-3、T24、5637、MB49。膀胱癌根治性膀胱切除术的90对正常和恶性组织

研究团队对T24细胞和T24-CR细胞进行代谢组学分析，寻找BCa获得顺铂耐药性后的差异代谢产物。在164种显著失调的代谢产物中(图1A)，确定了T24-CR细胞中与氨基酸代谢相关的16种下调代谢和50种上调代谢(图1B)。GSEA分析进一步发现了T24-CR细胞中的几种代谢途径，如谷氨酰胺代谢和碳代谢(图1C)。T24细胞与T24-CR细胞进行蛋白质组学分析，发现MAT2A在T24-CR细胞中高表达(图1D，E)。还发现T24-CR细胞中甲硫氨酸代谢的富集情况(图1F)。根据蛋白质组学数据，在这些代谢途径中，只有甲硫氨酸代谢的关键酶MAT2A在T24-CR细胞中上调，这表明甲硫氨酸代谢对顺铂耐药至关重要。在T24-CR细胞中，甲硫氨酸和SAM富集，而SAH下调，这意味着T24-CR细胞中甲硫氨酸的整体循环和甲基化反应增强，为表观遗传调控提供了必需的甲基供体。作为甲硫氨酸代谢的副产物，谷胱甘肽在T24-CR细胞中也被上调(图1D)。代谢组学和蛋白质组学的一致性分析表明，富集通路具有相对较好的相关性，这表明两个组学在顺铂耐药膀胱癌细胞中具有完美的相关性(图1G)。通过对蛋白质和代谢的综合多组学分析，发现甲硫氨酸代谢参与了BCa细胞的顺铂耐药。

为了探究顺铂耐药性、甲硫氨酸消耗量与癌症干细胞特征之间的关系。研究团队首先验证了甲硫氨酸代谢相关酶的蛋白表达。在顺铂耐药的BCa细胞中，MAT2A以及干细胞标志物CD44和Nanog高表达(图1H)。进一步敲低MAT2A或使用FIDAS(MAT2A的小分子抑制剂)下调T24-CR细胞中的MAT2A及其下游通路(图1I)。贴壁细胞失去了癌症干细胞标记以及对甲硫氨酸消耗的高需求，而维持在类器官中的细胞保留了这些特征。肿瘤干细胞的主要表型是高潜在的致瘤能力。当敲除MAT2A或通过FIDAS抑制MAT2A时，T24-CR细胞的球状体形成能力(图J)和致瘤能力(图1K、L)下降。T24-CR-shMAT2A (IC50 = 3.29μM) 和T24-CR-FIDAS(IC50 = 7.92μM)对顺铂的敏感性也高于T24-CR细胞(图1M)。这些发现强化了BCa的顺铂耐药增强了依赖于甲硫氨酸代谢的细胞干性。

研究团队对T24和T24-CR细胞以及5对良性和恶性膀胱组织进行了高通量circRNA测序(图2A，B)，发现了BCa中某些circRNA对顺铂耐药和癌变至关重要。从这两个数据集的交集中确定了四个下调的circRNA和三个上调的circRNA。进一步检测了这些T24-CR细胞中MAT2A的表达，其中某些circRNA被过度表达或下调。只有T24-CR过度表达，circOE2表达相对较低的MAT2A (图2C)，表明circOE2可能与MAT2A介导的甲硫氨酸代谢相关。T24-CR-circOE2细胞也具有较低的肿瘤形成能力(图2D，E)，表明circOE2干扰细胞干性。circOE2来源于circbank，名称为hsa_circ_0001449 (circARHGAP10)，一种来源于4号染色体ARHGAP10基因的222nt circRNA(图2F)。RNase R证明了线性转录的环状RNA的循环降低了BCa细胞中的线性ARHGAP10水平，而没有改变circARHGAP10水平(图2G)，放线菌素D处理表明，circARHGAP10在BCa细胞中比线性ARHGAP10更稳定(图2H)。甲硫氨酸和SAM以及参与顺铂耐药性的几种代谢产物(图1B，C)在T24-CR-circARHGAP10 OE细胞中下调(图2I)，说明 circARGHAP10与甲硫氨酸代谢相关的circRNA。作者还观察到MAT2A、干细胞标记物以及组蛋白甲基化标记物与circARHGAP10表达相关(图2J)，这最终决定了顺铂治疗期间BCa细胞的IC50(图2K)。T24和T24-CR细胞的球形形成能力(图2L)和致瘤能力(图2M，N)也显示了与circARHGAP10介导的MAT2A表达相关。进一步验证了circARHGAP10在90对BCa TMA中的表达情况(图2O)。

进一步发现MAT2A与circARHGAP10之间的调节机制。采用RIP法检测circARHGAP10在BCa细胞中是否具有miRNA海绵的功能。Ago2在抗ago2浓度显著升高，circARHGAP10未升高(图3A)。由于ago2介导的miRNA过程对miRNA代谢至关重要，在ago2和circARHGAP10之间未观察到相互作用，这表明circARHGAP10不是ceRNA。作者进一步使用RNA下拉法检测了circARHGAP10的表达能力。首先，验证了sense探针能够高效、特异地富集circARHGAP10(图3B)。通过SDS-PAGE、银染、质谱分析分离沉淀(图3C)。作者还发现MAT2A包含在丰富的相互作用蛋白中(图3D，E)，表明MAT2A和circARHGAP10之间存在直接相互作用。进一步鉴定了与MAT2A共定位的circARHGAP10(图3F)以及circARHGAP10与MAT2A之间的直接相互作用(图3G)。在circARHGAP10过表达的BCa细胞中，MAT2A的蛋白水平降低(图3H)，并通过MG132治疗消除了这种影响(图3I)。环己亚胺追踪实验分析确定，在circARHGAP10过度表达时，MAT2A的稳定性下降(图3J)。这些结果表明，circARHGAP10可能通过直接相互作用增强其泛素/蛋白酶体依赖性来破坏MAT2A的稳定性。

将T24和T24-CR细胞的蛋白组学与circARHGAP10的RNA-pulldown进行交叉质谱分析，进一步鉴定MAT2A泛素相关蛋白。两种E3连接酶TRIM25和ISG15，以及两种泛素特异性蛋白酶家族成员USP5和USP14在两个治疗组中显著交替(图4A)。在蛋白质组学分析中发现TRIM25在T24组上调，ISG15、USP5和USP14在T24-CR组中上调(图4B)。由于TRIM25下调或USP5和USP14上调会降低相关蛋白的泛素水平，因此选择这三种泛素相关蛋白进行进一步分析。然后观察到TRIM25，在顺铂耐药BCa细胞中与circARHGAP10相互作用(图4C)，通过TRIM25与MAT2A的直接相互作用，进一步确认TRIM25是否为MAT2A的E3连接酶。共免疫沉淀分析显示TRIM25直接与MAT2A相互作用(图4D)，免疫荧光(IF)证实TRIM25与MAT2A共定位(图4E)。TRIM25与MAT2A三维结构的分子对接也表明TRIM25与MAT2A之间存在直接相互作用(图4F)。TRIM25对MAT2A的mRNA水平没有影响，MAT2A蛋白显著增加(图4G)，TRIM25过表达时，MAT2A蛋白下调(图4H)。TRIM25ΔRBD对MAT2A蛋白水平没有影响(图4H)，这表明完整的RNAbinding结构域对MAT2A泛素化至关重要。