Edman降解法：N端测序分析
2023-08-29
中科新生命
2897随着现代医药工业的发展，出现了大量的蛋白质和多肽类药物分子,而蛋白质的N端氨基酸序列是生物药的关键质量属性之一。Edman降解法N端测序是分析这一属性的常规方法。通过Edman降解法分析N端的15个氨基酸序列在生物药申报时通常是必检项目；同时也是很多已上市生物药的年检项目（2020版中国药典《人用重组DNA蛋白制品总论》）。
此外，蛋白质的生物合成起始于N端，其N端序列的组成对生物学功能有着巨大的影响，例如蛋白质的半衰期、蛋白质在亚细胞器中的定位等等。并且N端可发生多种翻译后修饰，这些也与蛋白质的功能和稳定性息息相关。因此，Edman降解法对于蛋白质N端序列的分析，有利于帮助科研工作者分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。
N端氨基酸序列的确定在工业和科研中都有广泛的应用。那么Edman降解法N端测序的原理、结果以及送样的注意事项是什么呢？
第一步
Edman降解
通过PITC（苯异硫氰酸酯）这种有机试剂和蛋白或多肽N末端的α-氨基反应，使得N端的第一个氨基酸从序列上断裂得到游离的PTH-氨基酸如（原理图所示），生成的PTH氨基酸通过高效液相色谱进行分析，剩下的多肽蛋白序列依次进行上述反应，生成相应的PTH-氨基酸。
第二步
测序
断裂下来的PITC衍生氨基酸通过HPLC分离后，通过与标准品中各氨基酸出峰时间进行比对来判断氨基酸的种类。标准品检测图谱如下所示。
这样即完成一个循环，分析出了N端的第一个氨基酸。这一系列看似复杂的工作都已有自动化的测序仪来完成的。如现在市面上通用的，同时也是唯一一家在产的，岛津的PPSQ-31A/33A型蛋白测序仪。
第三步
分析结果
虽然自动化测序仪实现了对供试品的自动化测试，但实验结果依然需要实验员的智慧来分析结果；那么，通常我们会遇到哪些结果呢？（以第一个循环为例）
一般针对一个纯度达到95%以上的蛋白样品，测序结果出来是这样的：
清清楚楚，一个Val的峰。（DTT、DMPTU、DPTU为试剂峰）非常明确地表明所检测样品的N端第一个氨基酸是Val。
不过也有不一般的情况，有以下两种：
图谱中有多个氨基酸的峰。这是样品纯度不够、或者样品有降解（还是纯度不够）时会出现的情况。（可以用样品跑一下HPLC，或者跑个SDS-PAGE胶，也可以用质谱测分子量都可以看出样品纯度问题。）
干干净净，一个氨基酸的峰也没有！有两种原因会导致这种情况：1. N端封闭即N末端氨基酸的α-氨基被修饰（如发生了乙酰化修饰，Glu环化成焦谷氨酸等）；2. 上样量太少，信号强度达不到检测线。
经过以上实例分析，下次拿到结果是不是再也不会蒙圈儿了呢？
常见问题Q&A
虽然有自动化的测序仪，但Edman降解法N端测序的速度相比核酸测序可要慢多了。所以，在送样前该如何对自己的样品进行一个预判，看其是否适合用此方法来分析N端序列呢？
问
N端测序对蛋白样品纯度有要求吗？
答
是的。纯度最好能达到95%以上；否则每个循环有多个氨基酸出峰，无法归属到蛋白的序列。
问
蛋白有两条或者三条链，如何进行N端序列分析？
答
先进行SDS-PAGE电泳将条带分开，然后将胶上的蛋白转移到PVDF膜上，丽春红染色后，分别剪切下相应的条带进行测序。
这里有两点注意事项：转膜时不要使用Tris-甘氨酸缓冲液，其会在N端测序中产生较高的背景，推荐使用CAPS缓冲液。另外对PVDF膜染色时，不要使用考马斯亮蓝，应使用丽春红染色。
问
什么样的样品不适合用Edman降解法N端测序来分析序列？
答
第一，N末端封闭的样品：从反应原理可知，N末端的α-氨基被修饰后，反应无法进行；
第二，关注的N端序列中有太多非标准氨基酸，由于没有相应的标准品，也没有办法通过N端测序来分析。此时可改用质谱法进行序列确证。
