Gastroenterology（IF 29.4）| 基于机器学习算法开发的外泌体miRNA生物标志物用于胰腺导管腺癌早期诊断
2023-07-05
中科新生命
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胰腺导管腺癌（PDAC）的发病率在世界范围内不断上升，大多数患者在最初诊断时处于无法切除的状态。当前，唯一适用于临床的循环PDAC生物标志物是糖类抗原19-9（CA19-9），由于诊断标志物的灵敏度和特异性不足，主要用于患者随访期间；因此，开发PDAC替代的分子诊断生物标志物的需求亟需解决。新的研究结果表明，肿瘤来源的外泌体内容物，特别是miRNAs，为癌症特异性生物标志物的开发提供了一个极具吸引力的平台。
2022年11月，Gastroenterology（IF 29.4）上发表了一篇题为“An Exosome-based Transcriptomic Signature for Noninvasive, Early Detection of Patients With Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: A Multicenter Cohort Study”的多中心队列研究文章，该研究发现血浆中13个miRNA组成的Panel（5个cf-miRNA和8个exo-miRNA）可用于PDAC患者进行无创和稳健的检测，具有非常高的诊断性能。
研究材料
血浆和外泌体样本，发现集（n=101，44例早期PDAC患者和57例非疾病对照），训练集（n=96，62例早期PDAC患者和34例非疾病对照），验证集（n=95，62例早期PDAC患者和33例非疾病对照）
技术路线
步骤1：发现队列开展small RNA测序筛选差异miRNA，作为潜在的生物标志物；
步骤2：qRT-PCR对训练队列进行候选生物标志物检测及训练；
步骤3：qRT-PCR对验证队列进行候选生物标志物验证；
步骤4：优化miRNA Panel，开发一种临床可行且具有成本效益的检测方法；
步骤5：优化miRNA Panel联合血液中的CA19-9检测显著提高了PDAC的诊断准确性。
研究结果
1. 筛选差异miRNA，作为潜在的生物标志物
为了识别临床相关的循环miRNAs（cf-miRNAs）和外泌体miRNAs（exo-miRNAs）作为诊断PDAC患者的生物标志物，对早期PDAC（I期和II期）和非疾病对照患者的血浆样本和外泌体RNA样本进行了small RNA测序。通过差异miRNA的筛选（AUC值>0.7&|log2FC|>1，exo-miRNAs，AUC值>0.8&|log2FC|>1），鉴定出13个cf-miRNA和17个exo-miRNA作为潜在的生物标志物，这些miRNAs在I/II期PDAC患者中与非疾病对照组相比都显著上调（图1A和图1B）。并通过逻辑回归模型发现cf-miRNAs panel和exo-miRNAs panel相比于单个miRNA具有更好的诊断潜力。
图1 早期PDAC患者血浆和外泌体候选miRNA的表达水平
2. 使用qRT-PCR对候选生物标志物进行检测及训练
对从训练集患者获得的血液样本进行qRT-PCR的测定验证潜在的生物标志物，发现9个cf-miRNA和15个exo-miRNA在PDAC患者中显著上调。24个候选miRNA生物标志物随后被纳入逻辑回归分析，用于构建训练风险预测模型，以在训练集队列中识别PDAC患者。通过逻辑回归模型结果发现9个cf-miRNA Panel的AUC值为0.90（灵敏度为73%，特异性为94%），15个exo-miRNA Panel的AUC为0.97（灵敏度为87%，特异性为94%），exo-miRNA Panel联合cf-miRNA Panel的性能显著增强，AUC为0.98（灵敏度为94%，特异性为97%）。再次指出，联合Panel明显优于单个标记。
图2 对训练队列中潜在的miRNA生物标志物的性能评估
3. 使用qRT-PCR对候选生物标志物进行验证
接下来，通过在血浆标本中进行qRT-PCR的检测，在独立验证队列中验证miRNA检测的诊断潜力。结果发现cf-miRNA Panel（AUC=0.83，敏感性=79%，特异性=73%）和exo-miRNA Panel（AUC=0.89，敏感性=79%，特异性=94%；图3）在PDAC患者和对照组中表现优越。与训练队列的情况一样，联合cf-和exo miRNA Panel表现出更优越的诊断性能（AUC值为0.92，敏感性为87%，特异性为88%）。
图3 独立验证队列中验证miRNA检测的诊断潜力
4. 优化miRNA Panel，用于PDAC患者的无创识别
为了开发一种临床可行且具有成本效益的检测方法，使用向后选择法对候选miRNA生物标志物进行进一步选择，在减少panel中标志物数量的同时，又保证整体诊断性能。通过该方法共保留13个miRNA（包括5个cf-miRNAs，8个exo-miRNA）。接下来，对这13个miRNA构建逻辑回归模型，观察到在训练队列中，cf-miRNA和exo-miRNA Panel AUC值分别为0.90和0.96，联合cf-和exo miRNA Panel AUC值为0.98（图4A）。同样，将来自训练队列的风险预测模型应用于独立的临床验证队列，观察到联合Panel提供了更优越的诊断性能，AUC值为0.93（cf-miRNA Panel的AUC值0.84，exo miRNA Panel的AUC值为0.89,图4B）。
图4 优化miRNA Panel整体诊断性能评估
5. 优化的miRNA Panel联合血液中的CA19-9显著提高了对PDAC的诊断准确性
在常规临床实践中，CA19-9是唯一可用于PDAC患者诊断的血液生物标志物；然而，它缺乏在普通人群中早期检测所需的敏感性和特异性。因此，本研究将优化的miRNA Panel与CA19-9结合起来，以进一步提高临床诊断性能。结果发现，在PDAC的所有阶段CA19-9的AUC值为0.88，但当将CA19-9与优化的miRNA Panel相结合时，总体诊断性能显著改善，AUC值为0.99（图5A）。值得注意的是，即使在I和II期病变的早期PDAC患者中，这种联合诊断性能也同样显著提升（CA19-9的AUC值为0.86，优化的miRNA Panel与CA19-9联合AUC值为0.99，图5B）。
图5 优化的miRNA Panel联合血液中的CA19-9整体诊断性能评估
同时在这项研究中，使用优化的miRNA Panel以评估CA19-9水平低于37 U/ml（CA19-9检测阈值，该检测方法下PDAC呈阴性）的81名受试者（22名PDAC和59名非疾病对照）的转录组特征的表现。与之前的研究结果一致，优化的miRNA Panel表现出优异的诊断性能，可以识别22名PDAC患者中的20名（91%）（图6）。
图6 优化的miRNA Panel在PDAC假阴性患者中的诊断性能评估
文章小结
本研究对来自早期PDAC患者（I/II期）和非疾病对照受试者进行了血浆和外泌体的small RNA测序，确定cf-miRNA和exo-miRNA特征，并估其对PDAC患者早期检测的诊断性能，发现了13个miRNA组成的Panel（8个exo-miRNA和5个cf-miRNA）可用于PDAC患者早期检测，为基于外泌体的转录组标记用于无创、液体活检检测用于胰腺导管腺癌患者的临床意义提供了有希望的证据。
中科新生命
中科新生命与中科新生命特聘技术专家顾问、美国普渡大学终身教授陶纬国老师深度合作、潜心研发，完成从外泌体提取、表征到数据挖掘的外泌体多组学一站式解决方案，推动外泌体在精准医学领域的快速发展。
在数据分析模块，我司研发了一套以各组学或指标数据自身特征为前提，基于多种特征选择算法的集成机器学习方法的标志物筛选系统，它能筛选出高灵敏度、高准确率、高稳定性的潜在生物标志物，并构建高效、稳定的诊断模型。
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