项目文章J Exp Clin Canc Res (IF 13) | 女神节特刊！DIA联合单细胞技术揭秘不同时期宫颈癌肿瘤微环境
2023-03-08
中科新生命
2369
宫颈癌(CC)是全球女性第三大常见癌症，人乳头瘤病毒(HPV)16和18占CC的70%以上。I期CC细胞已经从子宫颈表面生长到更深的组织，而II期癌细胞有4厘米或更大，生长在子宫颈和子宫之外，但还没有扩散到骨盆壁或阴道下部。多组学和单细胞RNA测序技术的最新进展对肿瘤微环境（TME）的特征研究做出了重大贡献，从而发现了更多的细胞类型及其对治疗的反应。然而，目前对不同CC期TME的所有细胞类型进行分析以了解其细胞生物学的研究仍然有限。
2023年1月，佛山市第一人民医院刘晓松老师团队和袁颂华老师团队于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF 12.658）发表了题为“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer“文章，该研究利用snRNA-seq及DIA蛋白质组学分析比较了I期和II期CC患者TME内的细胞异质性和功能，并为开发诊断CC和治疗免疫抑制性TME的新方法奠定了基础。其中，中科新生命为该研究提供了DIA定量蛋白质组学服务。
研究样本
I期与II期CC患者的肿瘤组织
研究思路
步骤1：鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成；
步骤2：CCI组与CCII组间的细胞组成差异及细胞群差异表达基因分析；
步骤3：DIA定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在明显的免疫抑制。
研究结果
1. 鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成
作者首先对I期(n = 4)和II期(n = 3)供体肿瘤组织中分离的所有核（42928个I期和29200个II期）进行了snRNA-seq实验，并通过聚类分析将所有细胞分类成了22种细胞类型，且在I期和II期CC组中都存在。接着作者通过分析每类细胞群的差异表达基因，并结合文献中已标注的标记基因，对细胞群进行注释。注释结果显示，这22类细胞群与免疫反应直接相关的细胞有T细胞、巨噬细胞（MΦ）、γδT细胞、初始B细胞、成熟B细胞、Treg、NK细胞、CD141+CLEC9A+ DC细胞、pDCs，干细胞类型的有癌症干细胞(CSCs)、间充质干细胞(MSCs)、血管干细胞(VSCs)、祖细胞，此外还有上皮细胞、淋巴内皮细胞、肌成纤维细胞等。
图1 I期和II期宫颈癌患者肿瘤组织的snRNA-seq分析
2. CCI组与CCII组间的细胞组成差异及细胞群差异表达分析
在得到细胞群的注释结果后，作者进一步分析CCI组和CCII组间的细胞组成差异以及细胞亚群的差异表达基因。新的转录本AC244205.1被发现是CCII组中多种细胞类型如DCs、MΦs、T细胞、MSCs、NPCs和GMPCs中上调最多的DEGs之一，提示其可能在CC的进展中发挥作用。在CCII组多种细胞类型中，与线粒体呼吸机制相关的DEGs如MT-CYB、MT-CO2、MTCO3、MT-ND1、MT-ND2和MT-ND4的表达均升高，这意味着呼吸链上细胞色素的激活，导致了高水平的线粒体生物合成，这可能是由于肿瘤细胞生长在II阶段相对于I阶段的有显著的能量消耗，如EMT、“肌生成”、“缺氧”以及snRNA-seq分析表明的多种代谢过程。
CCI患者的MΦs显示出促炎功能，这表明IFN-α和IFN-γ反应信号显著激活，而CCII患者的MΦs显示出与细胞生长和组织发育相关的许多通路激活，其巨噬细胞主要表型为免疫抑制和促肿瘤生长。IGLL5是CCII组MΦs中随胶原和线粒体基因上调的DEG。值得注意的是，MMP11在CCII组的MΦs中几乎是独一无二的。MMP11在CC细胞系和宫颈前病变中过度表达，在乳腺癌中，MMP11的表达被认为是预后的生物标志物，这意味着类似的MMP11过程可能发生在CCII组的TME中。此外，CCL19、IL7R、SPARC、MGP、LUM和CXCR4在CCII组的MΦs和各个MΦ亚型中均高表达。
图2 CCI组和CCII组的MΦs显示不同的免疫应答水平
图3 CCI组和CCII组巨噬细胞异质性分析
实验结果中共鉴定出CD8+ T、γδT和Treg三种T细胞群。CCII组CD8+ T细胞的比例(12.85%)明显高于CCI组(8.58%)，然而尽管CCII组的CD8+ T细胞的数量明显更多，但其T细胞具有更强的免疫抑制作用。此外，CCI组的γδT细胞表达了许多干扰素诱导的基因和受体，而Treg和γδT的数量在CCII组中大幅减少。γδT细胞被发现可以抑制肿瘤生长，γδT细胞数量的显著减少可能与II期CC的高度肿瘤发生有关。这些结果表明CCII患者TME中T细胞功能受到抑制。
图4 CCII组患者的T细胞活性较低
CCI组的pDCs群体更高，而CCII组的B细胞群体更丰富。免疫反应，特别是MHC类I通路，在CCI组的DCs和B细胞中更为明显，而在CCII组的TME中，B细胞和DCs表现出MHC I类抗原的抑制过程。
图5 CCI组TME中的B细胞和DCs表现出增强的MHC类I通路
NK细胞的数量分别占CCI和CCII细胞的2.52%和0.85%。与CCI组相比，CCII组NK细胞的比例降低了60%以上，其中许多标志NK细胞功能激活的DEGs上调，尤其是成熟NK细胞和CD56bright NK细胞。CCI组显示出显著的“INF-γ反应”和“异体移植排斥反应”途径的高度激活。CCII组中最丰富的通路与细胞组织和组织发育有关，可能与更活跃的肿瘤生长有关。这对NK发育的二阶段NK细胞尤其显著，EMT通路的明显激活主要归因于CCII组FBN1、FN1、SERPINE1、VCAN等多种胶原蛋白的上调。因此，作者推测NK细胞中胶原的高丰度可能是对II期CC的TME中极低NK细胞数量的响应，以招募更多活性NK细胞。
图6 CCII患者TME中NK细胞功能受到抑制
在CCI组和CCII组中，与肿瘤进展相关的其他几种细胞类型，包括干细胞和上皮细胞，被确定为最高的种群。在CCI组的几种干细胞类型中，免疫反应相关通路普遍富集，而在CCII组中，细胞和组织生长以及代谢通路高度激活。
图7 肿瘤相关干细胞(TASCs)和上皮细胞在CCI患者的TME中更具有免疫反应活性
3. DIA定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在明显的免疫抑制
对CCI和CCII组进行DIA定量蛋白质组学检测，共鉴定出6181个蛋白质组。此外，作者根据DEPs和DEGs的FC值评估蛋白质谱与细胞类型之间的相关性，总的来说，相对于CCI患者，CCII患者形成了更强的免疫抑制TME。
GSEA分析显示，CCI组IFN-α和γ反应的激活与通过snRNA-seq分析得到的结果一致，特别是在免疫细胞类型中。CCII组DEPs上调与细胞外基质、细胞和组织发育及代谢密切相关，提示肿瘤发生程度更高。AKT1是相互作用程度最高的节点DEP。FN1是CCII组中与其他多个DEP相互作用上调最多的DEP，研究表明FN1通过激活FAK信号通路促进CC的发生。在CCI组DEPs上调方面，有一大群相互作用强烈的组蛋白，包括H2A/H2B和H4成员，它们在转录、DNA复制和修复中发挥重要作用。作者发现组蛋白基因可以作为CC患者生存预测的独立预后因素，包括本研究中检测到的HIST1H4A、HIST1H4E和HIST1H4K。这表明其他组蛋白也可以作为标志物，联合CCI组中上调的其他DEPs，如HSPs和干扰素反应相关蛋白，可用于早期发现CC。
图8 CCI (n = 3)和CCII (n = 3)患者肿瘤组织的定量蛋白质组学比较
小编小结
本研究通过使用snRNA-seq和DIA定量蛋白质组学，比较研究了I期和II期CC患者的TME。实验结果表明，II期CC患者几乎所有免疫细胞（包括MΦs、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞）的异质性都在很大程度上被调节，其表型明显具有免疫抑制作用。相比之下，这些细胞在I期CC患者中表现出增强的免疫反应，其中INF-α和γ反应是最激活的信号通路。此外，一些组蛋白显示出早期诊断CC的潜力。值得注意的是，对于II期CC患者，多种细胞类型的snRNA-seq分析和蛋白质组学分析分别鉴定出胶原蛋白的显著上调，提示它们可能被用作预后标志物。另外，本研究首次揭示了新型转录本AC244205.1的异常表达与II期CC的相关性。综上，这些发现为CC的临床诊断和免疫治疗提供了重要线索。
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