项目文章 | 中山大学李卓明教授团队采用乙酰化修饰组学和代谢组学揭示内皮细胞衰老新机制

血管老化不仅是人体衰老的始发关键因素，而且还是动脉粥样硬化等血管性疾病的共同病理基础。当长期暴露于心血管疾病危险因素中，血管内皮细胞呈现早熟性应激性衰老表型。近年来，内皮细胞的物质代谢，尤其是脂肪酸代谢，其病理生理意义越来越受到重视，但是内皮细胞脂肪酸代谢与内皮细胞衰老之间的关系尚不清楚。

2022年8月，中山大学李卓明教授研究团队在Oxidative Medicine and Cellular Longevity（IF 7.31）期刊上发表了题为“Disturbance of Fatty Acid Metabolism Promoted Vascular Endothelial Cell Senescence via Acetyl-CoA-Induced Protein Acetylation Modification”的文章，该文章利用乙酰化修饰组学和代谢组学等方法揭示了衰老内皮细胞中脂肪酸代谢的变化以及脂肪酸代谢在内皮衰老中的潜在调节机制，即脂肪酸代谢紊乱通过蛋白质乙酰化修饰促进血管内皮细胞的衰老。该研究为血管衰老及相关心血管疾病提供了靶向内皮细胞代谢的治疗策略。中科新生命为该研究提供了乙酰化修饰蛋白质组学和代谢组学技术服务。

H₂O₂诱导的内皮细胞衰老模型、细胞传导培养诱导的复制性内皮细胞衰老模型、自发性高血压大鼠和Ang II输注小鼠内皮衰老动物模型

在本研究中，通过检测H₂O₂诱导的内皮细胞衰老和细胞传导培养诱导的复制性内皮细胞衰老中棕榈酸基耗氧率(OCR)，研究脂肪酸代谢。结果表明，在内皮细胞衰老过程中，脂肪酸代谢下降（图1a-1d）。此外，通过代谢组学发现，在衰老内皮细胞中大部分中、长链脂肪酸、饱和及不饱和脂肪酸、亚油酸甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)、TCA周期相关有机酸代谢产物、FAO（脂肪酸氧化）的代谢产物乙酰辅酶A在衰老内皮细胞中均有所下降，NAD/NADH升高(图1e和1f)。综上所述，脂肪酸代谢紊乱与内皮细胞衰老有关。

为了探索脂肪酸代谢异常的可能机制，作者研究了衰老内皮细胞中脂肪酸摄取、转运和β-氧化相关蛋白的mRNA表达。结果表明与脂肪酸摄取相关的脂肪酸转运蛋白(FATP) 6、与转运相关的肉碱棕榈酰转移酶1 (CPT1)、肉碱棕榈酰转移酶2 (CPT2)均明显减少。这些结果表明，与脂肪酸摄取和线粒体进入相关的蛋白的下调抑制了内皮细胞衰老过程中的脂肪酸代谢。作者进一步深入研究了CPT1A（内皮细胞中高表达的CPT1亚型）蛋白的表达，结果表明在细胞水平（体外）和内皮衰老动物模型（体内）中，CPT1A的表达均明显减少，即表明CPT1A在内皮细胞衰老过程中受到抑制（图2）。

CPT1A被认为是内皮细胞中LCFA(长链脂肪酸)氧化的限速酶，因此衰老内皮细胞中CPT1A的下降可能通过抑制CPT1A依赖的LCFA从而导致内皮细胞衰老。为了验证这一假设，作者采用CPT1A siRNA、CPT1A抑制剂依托莫昔(ETO)和过表达CPT1A的方式研究内皮细胞衰老的机制。结果表明CPT1A的抑制（siRNA、ETO处理）增加了衰老细胞的比例、上调细胞周期因子的表达、降低增殖细胞的比例（图3a-3c），过表达CPT1A则逆转了上述现象（图3d-3f）。综上所述，CPT1A依赖的LCFA代谢可以防止内皮细胞衰老，抑制CPT1A可促进内皮细胞衰老。

与LCFAs不同，SCFAs（断链脂肪酸）不依赖于CPT1进入线粒体，为线粒体氧化途径补充脂酰。因此，在本研究中加入乙酸或丙酸（短链脂肪酸）研究CPT1A非依赖的SCFAs是否能够改善内皮细胞衰老。体外结果表明乙酸和醋酸均具有明显的抗衰老作用（图4a-c、图5），醋酸在体内实验中也显著改善了内皮层的衰老（图4d-4g）。

由于乙酰辅酶A是脂肪酸代谢的最终产物，因此内皮衰老过程中CPT1A依赖的LCFA氧化的减少可导致乙酰辅酶A水平改变（图6a和6b）。由此推测乙酰辅酶A在内皮细胞衰老中的发挥重要作用，因此作者使用了乙酰辅酶A的抑制剂-ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)抑制进行验证。结果表明乙酰辅酶A水平的降低可加剧内皮细胞的衰老（图6c-6f），乙酸和醋酸则逆转内皮细胞衰老（图6d-6f）。

由于乙酰辅酶A参与了内皮细胞衰老的调控，而乙酰辅酶A是赖氨酸乙酰化的主要乙酰基供体，由此推测乙酰辅酶A可能影响内皮细胞衰老过程中蛋白质乙酰化修饰。为了验证这一假设，作者开展了乙酰化修饰组学。此次共鉴定到2706个乙酰化蛋白，其中有43个乙酰化赖氨酸位点的40个蛋白质在衰老细胞中乙酰化水平显著降低（图7b-7d）, KEGG通路分析显示这些蛋白与细胞能量代谢、细胞周期密切相关（图7e）。综上所述，CPT1A依赖的脂肪酸代谢缺陷导致乙酰辅酶A缺失，导致蛋白质乙酰化被抑制，进而加剧细胞代谢，抑制细胞周期，最终导致内皮细胞衰老。