Adv Sci（IF 17.521）| 重庆医科大学第一附属医院通过外泌体多组学揭示膀胱癌肿瘤血管生成新机制
2022-11-04
中科新生命
2949
膀胱癌(BCa)是最常见的恶性肿瘤之一，具有强血管化的特点。畸形的肿瘤血管网络会引发营养缺乏的肿瘤微环境 (TME)，激活内皮细胞 (EC) 功能并刺激新血管形成，从而进一步促进癌症进展。因此，在肿瘤内应激环境的情况下，识别新的、可行的抗血管生成靶点对BCa的治疗具有较大的研究价值。
2022年9月，重庆医科大学第一附属医院苟欣教授团队首次发现驱动膀胱癌血管生成的新机制，以“Bladder Cancer-Derived Small Extracellular Vesicles Promote Tumor Angiogenesis by Inducing HBP-Related Metabolic Reprogramming and SerRS O-GlcNAcylation in Endothelial Cells”为题在线发表于Advanced Science。该研究团队结合外泌体多组学、蛋白质组学、代谢组学，首次发现在缺乏营养的肿瘤微环境中，BCa细胞和ECs之间存在一种新的代谢关联，即依赖于BCa细胞分泌的小细胞外囊泡（sEVs）作为媒介传递氨基己糖生物合成途径的关键限速酶——GFAT1。它作为一个关键的代谢开关，通过增加EC中氨基己糖生物合成途径的通量，实现葡萄糖代谢重编程，从而促进膀胱癌血管生成，为靶向治疗膀胱癌血管生成提供了新策略。
图1 BCa衍生的sEVs-GFAT1促进肿瘤血管生成模型
研究材料 膀胱癌组织、UM-UC-3细胞、293T细胞、HUVECs细胞、小鼠
技术路线 步骤1：BCa分离的ECs中HBP通量显著增加； 步骤2：GFAT1在BCa衍生的sEVs中富集并调节肿瘤血管生成； 步骤3：肿瘤内营养缺失的微环境促进膀胱癌细胞分泌sEVs-GFAT1，诱导血管生成； 步骤4：sEVs-GFAT1通过增强ECs中SerRS在Ser101位点的O-GlcNAc修饰来促进血管生成； 步骤5：SerRS在Ser101处的O-GlcNAc修饰通过诱导泛素化降低其稳定性，并阻碍α5蛋白介导的核转运； 步骤6：SerRS在Ser101上的O-GlcNAc修饰阻碍了SerRS诱导的核内VEGFA转录抑制； 步骤7：BCa衍生的sEVs-GFAT1促进ECs中SerRS的O-GlcNAc糖基化，促进体内肿瘤血管生成。
研究结果 1. BCa分离的ECs中HBP通量显著增加 作者首先通过流式细胞术检测96例肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）患者和配对的正常膀胱尿路上皮和肿瘤组织以及124例非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）患者单个肿瘤组织中的EC百分比，结果显示MIBC患者肿瘤组织中的EC（Tu-ECs）百分比显著高于配对正常膀胱尿路上皮组织和NMIBC患者的肿瘤组织。接下来，作者从MIBC患者配对的组织中分离和纯化ECs，并利用代谢组学分析来揭示葡萄糖代谢的特征。结果揭示了GFAT1作为HBP中的开关和关键的速率限制酶，可能通过加速肿瘤组织ECs中的HBP通量来重新规划葡萄糖代谢过程。之后作者继续探究GFAT1在Tu-ECs中的水平是否相应升高，以及是否在血管生成中起关键作用。相关分析结果显示，Tu-ECs中GFAT1和O-GlcNAc均有较高的表达水平，且与较大的EC百分比显著相关。基于这些发现，作者推断GFAT1促进葡萄糖代谢向HBP分支转移，增加Tu-ECs中的O-GlcNAc修饰，最终诱导血管生成。
图2 GFAT1通过增加ECs中的HBP通量来重编程葡萄糖代谢，从而增强蛋白质O-GlcNAc修饰
2. GFAT1在BCa衍生的sEVs中富集并调节肿瘤血管生成 为了探究GFAT1在ECs中的作用机制，作者从正常尿路上皮细胞（sEVsNC）和BCa细胞（sEVsTu）的培养基中分离出sEVs，并使用4D-label free 检测其蛋白表达情况。通过GO、KEGG分析，表明GFAT1在BCa衍生的sEVs中富集。为了进一步研究BCa源性sEVs中装载GFAT1(sEVs-GFAT1)的临床意义，作者从MIBC患者术前（pre-usEVs）和术后第30天的尿液样本（post-usEVs）中分离出sEVs，并检测其中GFAT1的浓度。结果显示，post-usEVs中GFAT1水平显著降低。这些结果表明，sEVs-GFAT1是一种潜在的TME调节因子，能够调节ECs的HBP相关代谢和血管生成功能。
图3 BCa衍生的sEVs-GFAT1调节肿瘤血管生成
3. 肿瘤内营养缺失的微环境促进膀胱癌细胞分泌sEVs-GFAT1，诱导血管生成 接下来，作者通过建立GFKO和OEGF稳定细胞系及构建体外营养剥夺模型，发现营养匮乏的肿瘤内微环境刺激了膀胱癌细胞中GFAT1的表达和sEVs介导的分泌。为了进一步了解sEVs-GFAT1在ECs中的作用和机制，作者建立了一系列体外模型来模拟TME，发现BCa分泌的GFAT1通过sEVs引起了ECs中GFAT1和O-GlcNAc修饰水平的升高。此外，提高O-GlcNAc修饰水平能够全面增强血管生成能力，而抑制O-GlcNAc修饰则抑制了GFAT1过表达引起的血管生成增加。这些结果表明，sEVs-GFAT1通过加强O-GlcNAc修饰来促进血管生成。 图4 营养匮乏的肿瘤内微环境促进膀胱癌细胞分泌sEVs-GFAT1，诱导血管生成 4. sEVs-GFAT1通过增强ECs中SerRS在Ser101处的O-GlcNAcylation来促进血管生成 接着作者探究了GFAT1加强的O-GlcNAc修饰蛋白如何促进血管生成。通过质谱鉴定分析，发现SerRS在血管生成途径中显著富集。此外，作者比较了NC-ECs和Tu-ECs中O-GlcNAcylated SerRS的水平，结果表明Tu-Ecs中SerRS水平存在不同程度的升高。进一步的，体外细胞实验证明，SerRS与O-GlcNAc之间存在明显的相互作用，且Ser101位点被替换后，SerRS的O-GlcNAc修饰水平急剧降低，表明Ser101是SerRS上负责O-GlcNAc修饰的主要位点。最后，作者检测了SerRS在Ser101位点的O-GlcNAc修饰在血管生成中的作用，并揭示了GFTA1介导的SerRS 通过提高O-GlcNAc修饰水平能够增强ECs的血管生成活性。 图5 sEVs-GFAT1通过增强Ecs中SerRS在Ser101位点的O-GlcNAcylation来促进血管生成 5. SerRS在Ser101处的O-GlcNAc糖基化通过诱导泛素化降低其稳定性，并阻碍α5蛋白介导的核转运 作者发现在Ser101位点上O-GlcNAc糖基化会降低SerRS的稳定性。为了深入了解SerRS稳定性的调控机制，作者进一步探索了O-GlcNAc修饰是否促进了蛋白酶体介导的SerRS降解。体外实验结果表明，来自BCa细胞分泌的sEVs的外源性GFAT1增加SerRS的O-GlcNAc修饰水平，促进ECs中泛素化介导的SerRS降解。进一步的研究发现，SerRS核易位对其抑制血管生成的作用至关重要，而SerRS在Ser101位点上的O-GlcNAc糖基化会通过减弱输入蛋白α5和NLS基序之间的相互作用，来阻止输入蛋白α5介导的SerRS核易位。 图6 SerRS在Ser101处的O-GlcNAc糖基化通过诱导泛素化降低其稳定性，并阻碍α5蛋白介导的核转运 6. SerRS在Ser101上的O-GlcNAc糖基化阻碍了SerRS诱导的核内VEGFA转录抑制 VEGFA在血管生成中具有不可或缺的作用，因此作者将研究重点转向了SerRS的O-GlcNAc糖基化促进VEGFA转录的可能性。研究发现抑制O-GlcNAc糖基化会导致VEGFA水平的降低，而补充来自饥饿BCa细胞的sEVs会不同程度地增加VEGFA的mRNA和蛋白水平。这些结果表明，Ser101上的O-GlcNAc糖基化促进了NLS基序引导的SerRS核易位，从而导致VEGFA转录水平的增加。 图7 SerRS在Ser101上的O-GlcNAc糖基化阻碍了SerRS诱导的核内VEGFA转录抑制 7. BCa衍生的sEVs-GFAT1促进Ecs中SerRS的O-GlcNAc糖基化，促进体内肿瘤血管生成 接下来，作者通过建立BCa细胞系衍生的异种移植（CDX）裸鼠模型，进一步在体内验证上述结果。作者通过流式细胞术检测肿瘤中EC的百分率，结果与肿瘤生长趋势一致，即OEGF小鼠肿瘤中EC百分比最高，而OSMI-1小鼠和DON小鼠肿瘤中EC百分比相对较低，表明GFAT1水平升高有利于肿瘤血管生成。之后作者从肿瘤组织中分离纯化出ECs，以进一步验证其功能和机制。通过蛋白质谱及IHC等方法，表明BCa分泌的sEVs -GFAT1通过增加ECs中SerRS的O-GlcNAc修饰增加VEGFA水平，促进肿瘤血管生成。 图8 sEVs-GFAT1在BCa CDX裸鼠模型中促进肿瘤血管生成 图9 ECs中的SerRS通过O-GlcNAc糖基化促进GFAT1敲除小鼠原位膀胱肿瘤的血管生成 小结 该文章证明了营养缺乏的肿瘤微环境会促进膀胱癌细胞衍生的含GFAT1的sEVs分泌，并通过增加ECs中的HBP通量重新编程葡萄糖代谢，从而增强 O-GlcNAc糖基化。此外， ECs中SerRS在Ser101处的O-GlcNAc修饰通过泛素化促进其降解并阻碍输入蛋白 α5 介导的核易位，从而降低VEGFA的转录抑制并增强血管生成活性。总之，本研究结果为BCa衍生的sEVs-GFAT1对TME代谢重编程的影响提供了一个新的视角，并扩展了对HBP诱导的内皮细胞SerRS发生O-GlcNAc糖基化促进肿瘤血管生成的理解，为BCa抗血管生成治疗的新靶点提供了新线索。 中科优品推荐 【中科新生命】提供外泌体“提取-表征-组学分析（蛋白质组、磷酸化修饰组、脂质组）-数据挖掘”全流程服务，全程高质量保证，为您的课题研究保驾护航！明天外泌体领域多位重量级老师为您分享外泌体最新研究进展，欢迎各位老师报名参加。
