Nature重磅: 组学领军大牛Matthias Mann等揭示JAK2突变肿瘤耐受性机制，为后续用药提供指导

Janus激酶（JAKs）是造血细胞发育至关重要的一个调控激酶。研究发现，JAK基因（JAK2）常常发生突变，其突变组成性激活下游信号转导网络，导致骨髓增生性肿瘤（MPN）等血液疾病发生。临床上，采用靶向激酶抑制剂用药能取得疗效，然而采用JAK抑制剂治疗肿瘤效果却十分有限，这是由于JAK突变的存在导致了疾病持久性。因此，揭示JAK2突变下游的信号通路变化，对于阐明疾病持久性以及指导用药具有重要意义。

2020年11月，来自德国马普所Matthias Mann、耶拿大学附属医院Florian Heide等团队合作，在顶级期刊Nature（IF=42.8）上发表了"Splicing factor YBX1 mediates persistence of JAK2-mutated neoplasms"的文章，通过深度磷酸化蛋白质组、转录组等多种技术方法，筛选到了JAK2突变下游关键靶标YBX1，其受JAK2磷酸化调控，并通过RNA剪切过程参与ERK等信号通路调节，介导肿瘤持久性。针对JAK2抑制结合YBX1依赖信号通路药物联用，能消除JAK2突变肿瘤细胞，提升治疗效果。

研究材料：

小鼠造血细胞（JAK2WT野生型、JAK2VF突变型）；人骨髓（正常人、MPN患者）；JAK2突变的YBX1条件敲除小鼠（Ybx1+/+ JAK2VF、Ybx1-/- JAK2VF）；小鼠及人骨髓细胞（JAK2WT野生型、JAK2VF突变型）

技术方法：

磷酸化修饰组、RNAi、转录组等

实验线路图：

实验结果

1. 磷酸化修饰组 & RNAi：筛选JAK2突变下游的关键变化通路和蛋白YBX1

为了找到JAK2突变下游的效应分子，采用深度磷酸化修饰组分析了野生型JAK2（JAK2WT）与突变体JAK2-V617F（JAK2VF）小鼠造血细胞中的磷酸化变化。实验共鉴定到21764个磷酸化位点、4135种磷酸化蛋白，其中1758个蛋白上5191个磷酸化位点发生差异变化，包括一些JAK已知靶点，如STAT、PIM、ERK等。GO功能分析发现，这些修饰蛋白在mRNA剪切加工过程富集，表明该过程可能参与到JAK2突变引起的肿瘤持久性疾病特征中。进一步筛选关键靶标蛋白，采用RNAi敲低上述过程中15个变化最显著的蛋白，利用细胞存活实验分析它们发挥的作用。结果筛选到一个关键靶标——mRNA核心剪切因子Y-box-binding protein（YBX1），在JAK抑制剂处理条件下，其敲低引起JAK2突变细胞生长及活力下降。综上表明， YBX1是JAK2突变下游的关键靶标蛋白。

2. 探究YBX1功能：YBX1介导JAK2突变细胞的持久性，对YBX1抑制会诱发突变细胞凋亡

为了证明YBX1参与了MPN肿瘤的发生发展，首先比较了正常人骨髓与JAK突变MPN患者骨髓中YBX1表达情况，发现MPN患者骨髓中YBX1呈现高表达。进一步探究YBX1在JAK2突变中发挥功能，发现YBX1与JAK2突变体能发生相互作用，且在JAK抑制剂处理条件下抑制YBX1功能，发现无论JAK2突变人还是小鼠细胞均有细胞生长受损、凋亡现象。综上表明，YBX1介导了JAK2突变细胞的存活和持久性，在JAK抑制剂处理下对YBX1抑制能引发突变细胞凋亡。

进一步，作者猜想YBX1抑制引发凋亡可为改善疾病治疗提供依据。为证明可行性，构建了YBX1条件敲除小鼠，随后分别取YBX1敲除的（Ybx1+/+ JAK2VF）以及YBX1表达的JAK突变小鼠（Ybx1-/- JAK2VF）骨髓进行移植实验，并对移植受体小鼠进行疾病特征分析。结果显示，移植YBX1敲除骨髓的受体小鼠并未表现出血液疾病相关特征，但移植YBX1正常表达骨髓的受体鼠则表现出白细胞血症、血小板增多等一系列疾病症状。同时，在JAK2突变人细胞上也进行了异种移植实验，得到了相似结论。

3. 解析YBX1的调控机制：JAK2突变调控YBX1磷酸化，影响ERK通路中MKNK1蛋白的mRNA剪切和转录

为分析JAK2突变如何调控YBX1，挑选JAK2下游已知靶标进行抑制，利用磷酸化组分析YBX1变化，结果发现MAPK信号中的MER、ERK抑制使YBX1的S30、S34残基发生显著磷酸化变化，深入功能分析发现，YBX1与MAPK1能发生相互作用，且JAK2-MAPK调控YBX1磷酸化会进一步影响YBX1入核。

为深入分析YBX1如何调控下游转录过程，对YBX1敲低后JAK2突变细胞进行转录组分析，GO功能分析发现炎症、MAPK、ERK等过程显著富集，其中ERK通路中关键蛋白的表达MKNK1发生mRNA表达显著下调。结合YBX1功能是调控RNA剪切，并影响内含子保留、mRNA表达，采用剪切抑制剂抑制mRNA剪切过程，发现MKNK1表达依赖于Mknk1 高效剪切，且表达YBX1磷酸化位点突变体会抑制Mknk1转录。综上表明，JAK2突变-MAPK调控YBX1磷酸化影响其入核，而YBX1的磷酸化变化则通过影响mRNA高效剪接过程调控MKNK1转录。

4. 靶向MKNK1-ERK 信号通路、揭示其治疗价值

由于在磷酸化组分析中，发现JAK2突变下游诸多磷酸化变化底物与ERK信号通路相关，且MKNK1被证明是ERK相关靶点。故进一步分析了JAK2突变中YBX1对MKNK1-ERK 信号通路影响，结果发现，对YBX1抑制后会影响ERK磷酸化变化。同时，在JAK抑制剂处理下，敲低MKNK1会抑制ERK信号通路并导致细胞死亡。综上表明，YBX1通过调控MKNK1转录表达，参与到ERK信号通路的调控。基于以上结论，采用MKNK1或ERK信号的调节剂与JAK抑制剂结合使用，发现药物联用能够诱导小鼠及人的JAK2突变骨髓细胞的凋亡，且在异种移植模型实验中，能抑制JAK2突变肿瘤细胞增殖，减少疾病特征表现。

总结

通过深度磷酸化蛋白质组结合RNAi筛选，找到了JAK2突变下游关键靶标YBX1，进一步机制研究发现YBX1受JAK2的磷酸化调控，并通过RNA剪切过程参与ERK等信号通路调控，介导肿瘤持久性。在JAK抑制剂处理条件下， 对YBX1抑制能导致mRNA错误剪切、ERK信号通路紊乱，引起细胞凋亡。基于此，将JAK2抑制结合YBX1依赖的信号通路的药物联用，能够消除JAK2突变肿瘤细胞，为改善JAK2突变肿瘤治疗效果提供后续用药指导。

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