【Cell】肿瘤微环境：单细胞组学和磷酸化蛋白组学揭示胰腺癌瘤内结构塑造机制

胰腺癌（pancreatic cancer）是常见的消化道恶性肿瘤之一，因其早期缺乏特异性症状，确诊时大多处于晚期，死亡率较高，被称为“癌中之王”。由外分泌细胞产生的胰腺导管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）占所有胰腺癌的90%，其间质微环境主要由免疫细胞、内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）所组成。CAF的大量浸润是PDAC的重要特征且已有研究对其促进肿瘤细胞生长、抑制肿瘤微环境内免疫反应以及增强肿瘤细胞转移扩散有很多报道。然而在小鼠模型中的研究表明，基质CAFs的减少可导致更具攻击性的PDAC行为。上述结果表明PDAC和CAF细胞之间有着复杂而微妙的相互作用，且这种相互作用不是一致的刺激或抑制作用。

2019年6月27日, 波士顿马萨诸塞州总医院团队在Cell上发表文章，题目为“Stromal Microenvironment Shapes the Intratumoral Architecture of Pancreatic Cancer”。通过单细胞RNA测序(single cell RNA-sequencing, scRNA-seq)与RNA原位杂交技术（RNA in situ hybridization, RNA-ISH）对胰腺癌瘤内结构进行了精确表征，利用磷酸化蛋白质组学技术对CAF通过分泌TGF-β等激活MAPK和STAT3信号通路，影响PDAC中的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）特性或是增殖(proliferative, PRO)特性的亚细胞群的细胞比例，从而对瘤内结构的塑造机制进行了解析。

Cell   IF=36.216

研究材料

胰腺癌肿瘤细胞系PDAC-3、CAF细胞系CAF-1、6种不同的人源PDACs、195个PDAC病人原位肿瘤组织的组织芯片等

技术方法

单细胞RNA测序、RNA原位杂交、磷酸化蛋白质组学、分泌蛋白蛋白质组学

研究路线

研究结果

01 单细胞转录组学揭示CAFs与PADC细胞共培养，可导致患者来源PADC细胞出现EMT和PRO特征

为了解基质微环境对PDAC细胞转录程序的影响，作者利用GFP-荧光素酶胰腺癌细胞株(PDAC-3)和mCherry CAF细胞株(CAF-1)以不同的比例(50:50、30:70和10:90 PDAC:CAF)进行共培养，以捕捉人原代PDAC中不同间质含量的光谱。72h后，分别对92个PDAC和CAF细胞进行不同条件下的显微操作和scRNA-seq测序。通过对EMT和PRO特性的相关基因进行量化分析发现，不同培养比例中具有EMT和或PRO特性的PDAC-3细胞数目有所不同: 在没有CAF的情况下，65%的PDAC细胞对PRO或EMT基因呈现双阴性(DN)，而在50:50 PDAC:CAF共培养条件下，PDAC细胞从这种DN状态转变为PRO、EMT或DP（双阳性）特性细胞的混合状态。而同时共表达PRO和EMT(DP，双阳性)表型的细胞，主要存在于最高的CAF共培养条件(10:90)。以上结果表明这些发现证明了PDAC:CAF crosstalk在PDAC单细胞异质性发展中的重要性。

图1 PDAC:CAF共培养改变PDAC细胞异质性，并与DP(PRO+EMT)表型相关

02 CAF条件培养基(CAF-CM)促进PDAC细胞系的PRO和EMT表型

为了检测CAFs的分泌因子是否能够诱导PDAC肿瘤细胞向具有EMT和PRO特性的细胞转变，研究人员对暴露于CAFs条件培养基的6个PDAC细胞系进行流式细胞术（flow cytometry）分析，结果发现CAFs条件培养基刺激后DP双阳性细胞数量显著增多(图2B)，且这些细胞具有更强的增殖能力(图2C)。

研究者将这一实验扩展到免疫缺陷小鼠中，由PDAC-3和CAF细胞以不同比例(PDAC:CAF)组成胰腺原位肿瘤，使用体内荧光素酶成像，观察到与体外数据(图1D和2C)一致的结果，10:90 PDAC:CAF组的原发肿瘤生长明显更快(4周时比对照大7.93)，但在30:70 PDAC:CAF组(图2E)的原位肿瘤生长速度不明显。

体内和体外实验结果表明基质含量的变化调节PDAC细胞转录谱，导致多个患者来源的PDAC细胞系增殖和转移能力明显增强。

图2 CAF条件培养基(CAF-CM)促进PDAC细胞系的PRO和EMT功能行为

03 CAF-CM激活DP细胞中MAPK、STAT3信号通路

研究者对暴露于CAF-CM的PDAC-3细胞进行了时间梯度实验，分别对5分钟、15分钟、1小时、3小时和24小时的细胞样品进行磷酸化蛋白质组学分析。实验显示EMT和PRO的发展过程中，MAPK通路(MEK/ERK)在早期激活，随后在24小时上调STAT3通路(STAT3)(图3B；表S2)。接着通过磷酸化免疫印迹证实24和72h时 MAPK和STAT3在PDAC-3细胞中共激活。

为了证实MAPK和STAT3信号在EMT和PRO行为中的重要功能，研究者在5个PDAC细胞系上使用了MAPK/MEK的小分子抑制剂(Meki，Trametinib)和两种STAT3的抑制剂(STAT3i，SH-4-54或乙胺嘧啶)处理，发现Meki和STAT3i联合使用对CAF共培养比率较高的多个PDAC细胞株(PDAC-2、PDAC-3、PDAC-6、PDAC-9)的作用增强。同时作者也培养了含或不含CAF-CM的PDAC细胞系，并证明在DP细胞中MAPK/STAT3激活显著富集。为了在患者中验证这些发现，研究者对来自不同PDAC患者（三个原发肿瘤和一个肝转移瘤）进行了多重流式细胞术(FN1、Ki67、p-STAT3、p-ERK、CK-7和CK-19)分析。这组实验证实了在DP细胞中MAPK和STAT3的特异性共激活(图4D-4F)，这在另一个由CyTOF分析的人类原发肿瘤中也可以看到相同的实验结果。综上所述，这些结果表明人原发性和转移性PDAC肿瘤细胞系模型中MAPK和STAT3通路被激活。

图3 CAF-CM激活PDAC细胞中的MAPK和STAT3信号通路

图4 DP细胞中MAPK和STAT3通路特异性共激活

04 分泌蛋白分析确定CAF分泌的转化生长因子β1 (TGF-β1)驱动PDAC细胞的DP表型

在验证了CAF-CM存在时EMT和PRO表型的变化之后，研究者接下来试图确定导致这些表型变化的CAF分泌因子。通过对无血清CAF-CM与四个PDAC细胞系的分泌蛋白进行质谱分析，富集得到了与DP诱导高度相关的7个蛋白质，其中包括TGF-β1，一种公认的与癌细胞侵袭和进展有关的分泌因子。并通过随后的ELISA实验证实TGF-β1的差异；通过TGF-β1中和抗体处理对细胞增殖作用的消除以及重组TGF-β1作用于5个PDAC细胞系的增强增殖作用等实验证实TGF-β1是PDAC细胞系增殖能力增强的重要因素。

图5 CAF分泌的TGF-β1驱动PDAC细胞株的DP表型

05 RNA-ISH证实原发性人PDAC肿瘤的EMT和PRO单细胞表型

研究者进一步对195例人原发性PDAC肿瘤进行了RNA-ISH，以检测MKI67和FN1的表达。对这些病人的3593个肿瘤腺体，共计319626个癌细胞进行分析发现，具有PRO特性、EMT特性、DP和DN特性的细胞比例分别为11.9%、17.5%、11%和59.6% 。为了比较不同特性细胞病人的生存状况，研究人员使用单个细胞（single cell）和单个肿瘤腺体（tumor gland）为单位对这些数据进行标准化。结果显示，以肿瘤腺体的细胞类型为单位时，DP、PRO和DN细胞都成为具有统计学意义的预后标志物，证明了不同类型肿瘤腺体的组成与病人的生存状况相关。

图6 在原发性PDAC肿瘤的结构中，肿瘤腺体是独立的“单位”

06 人原发性PDAC肿瘤间质含量与肿瘤腺体的不同类型相关

当考虑肿瘤腺体，细胞类型（DP、EMT、PRO和DN）对患者预后的异质性影响，提示存在不同的腺体类型。因此研究者根据肿瘤腺体的内部细胞组成定义了8种类型。通过这些分类，研究者观察到患者之间和患者内部腺体类型组成的异质性，并评估了人PDAC肿瘤的间质含量与腺体异质性的关系，发现间质丰度和肿瘤腺体类型之间的联系也验证了临床前模型的相关性。

为了确定肿瘤腺体潜在的功能相关性，研究者用RNA-ISH对异种原位肿瘤进行染色，以比较原发肿瘤和远处转移肿瘤腺体的组成成分，发现远端肝转移仅含有包含EMT和DP的腺体(II型和IV型)，这表明在转移定植时这些细胞类型发生富集。对患者队列中的每一种腺体类型进行了单变量生存分析(Kaplan-Meier)，发现主要含有DP或EMT细胞(I型、II型和IV型)的肿瘤腺体与患者生存恶化有显著的相关性。相反，腺体不含任何DP或EMT细胞，而只含有PRO细胞(III型)，与病人的高存活率有关。研究者进行了包括所有腺体类型和单细胞表型(DP、PRO、EMT和DN)的多变量Cox回归分析，发现I型腺体(以DP为主的腺体)仍然具有统计学意义，即I型腺体的存在提供了独立于常规临床参数的预后信息，这些信息不同于接受早期手术切除的PDAC患者。

结合文献报道的临床试验，术前(新辅助)FOLFIRINOX化疗和放射治疗可以提高PDAC的切除率和长期存活率，研究者为了确定面对强毒化疗是否选择某些腺体类型进行了研究：对25名进行了RNA-ISH分析，并对416个肿瘤腺体中的22959个癌细胞进行评分，发现除了II型和IV型腺体(EMT和EMT+DP)外，所有腺体类型都显著减少。这表明在细胞毒性显著的环境中，选择了特定的腺体类型。总之，这些数据强调了基质在形成单细胞和肿瘤异质性方面的重要性，这对PDAC肿瘤生物学、对细胞毒性治疗的反应和患者生存率有很大影响。

图7 基质含量和细胞毒性治疗与原发性PDAC肿瘤腺体的不同类型相关

研究亮点总结

本研究利用系统生物学方法对肿瘤微环境与肿瘤表型的作用关系进行了全面研究：

①利用单细胞转录组学对肿瘤微环境中的细胞表达模式进行表征，确立了不同基因表达模式的细胞表型。

②利用磷酸化蛋白质组学技术确立了CAF通过激活肿瘤细胞内MAPK和STAT3双信号通路，来诱导肿瘤细胞发生EMT和PRO的转变，从而具有更强的侵袭和增殖能力。

③利用细胞分泌蛋白质组学技术筛选了CAFs通过释放TGF-β1来实现对肿瘤细胞内MAPK和STAT3双信号通路的激活。

④通过RNA-ISH实现对瘤内细胞的表征，从而分析瘤内不同单细胞特性，对瘤内腺体进行分类，从而清晰阐述了胰腺癌肿瘤内部结构组成。

本研究一方面发现了肿瘤基质微环境对胰腺导管腺癌表型的显著影响，找到了与预后相关的表型；另一方面清晰阐述了胰腺癌肿瘤内部结构组成，为揭示和研究肿瘤异质性提供了证据。